ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 6, с. 668-672
= БИОХИМИЯ =
УДК 577.152.344:537.63
ВЛИЯНИЕ СЛАБЫХ НИЗКОЧАСТОТНЫХ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ КАЛЬЦИЙЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ РЫБ
© 2013 г. Н. П. Канцерова*, Н. В. Ушакова**, В. В. Крылов**, Л. А. Лысенко*, Н. Н. Немова*
*Институт биологии Карельского научного центра РАН, 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11 **Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742Ярославская обл.,
Некоузский р-он, пос. Борок E-mail: nkantserova@yandex.ru Поступила в редакцию 10.12.2012 г.
В экспериментах in vivo и in vitro исследовано влияние слабых низкочастотных магнитных полей с параметрами резонанса для ионов кальция на внутриклеточные кальцийзависимые протеиназы (кальпаины) карася Carassius carassius (L.) и плотвы Rutilus rutilus (L.). Показано, что воздействие слабого низкочастотного магнитного поля приводит к значительному снижению активности каль-паинов в скелетных мышцах и мозге рыб.
DOI: 10.7868/S0002332913060088
К настоящему моменту имеется немало сведений о влиянии слабых низкочастотных магнитных полей (МП) (амплитуда которых сравнима или значительно меньше амплитуды геомагнитного поля) на различные морфологические, физиологические и биохимические показатели живых организмов (Бинги, Савин, 2003; 1ииШатеп, 2003; Крылов, 2008; Бапйт вг а1, 2009; Ьа§гоуе вга1., 2011). Слабые низкочастотные МП могут быть естественного и техногенного происхождения. В связи с этим исследование их биологических эффектов необходимо для понимания механизма действия как естественных флуктуаций МП, возникающих, например, в периоды магнитных бурь, так и антропогенного электромагнитного загрязнения.
К основным мишеням воздействия МП в живых организмах относят различные ионы, и прежде всего ионы кальция (НЬоНТ, 1985; Ьеёпеу, 1991; Jenrow вг а1, 1995). Несмотря на то что влияние слабых низкочастотных МП на внутриклеточный кальций и его комплексы с кальцийсвязывающи-ми белками отмечено давно (ЫЪоГГ, 1985; Ьеёпеу, 1991), основные кальцийрегулируемые процессы в данном аспекте практически не исследовались. Вместе с тем это направление исследований весьма перспективно, если учесть разнообразие в клетке известных кальцийсвязывающих белков и регулируемых ими внутриклеточных процессов. Связывание кальция указанными белками обычно сопровождается изменением их конформации и/или активацией с последующим запуском регулируемого ими каскадного процесса, как это происходит в сигнальных путях протеинкиназы С или кальцийзависимых протеиназ (кальпаинов).
В связи с вышеизложенным изучение влияния слабых низкочастотных МП на кальцийзависимые протеиназы семейства кальпаинов может существенно дополнить как представления о механизме действия МП на живую клетку, так и сведения о биологии самой протеолитической системы. К настоящему времени система кальцийзависи-мого протеолиза рассматривается как одна из важнейших регуляторных систем клеток высших эукариот, поскольку кальпаины помимо участия в базовом обмене тканевых белков регулируют разнообразные клеточные процессы — от пролиферации до гибели (Goll etal., 2003; Немова и др., 2010; Sorimachi et al., 2011). Следует отметить, что влияние МП на данную ферментную систему практически не изучено.
Цель работы — исследование активности внутриклеточных кальцийзависимых протеиназ (каль-паинов) рыб при воздействии (прижизненном и in vitro) слабых низкочастотных МП с параметрами резонанса для ионов кальция с помощью интерференционной модели, предложенной В.В. Ледне-вым (Белова, Панчелюга, 2010).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования были использованы рыбы сем. карповых — карась Carassius carassius (L.) (возраст 1+, длина 6.0 ± 0.3 см, масса 3.8 ± 0.4 г) и плотва Rutilus rutilus (L.) (возраст 0+, длина 7.5 ± 0.1 см, масса 5.1 ± 0.3 г), выращенные в экспериментальном прудовом хозяйстве "Сунога" ИБВВ РАН. После вылова рыбы содержались в аквариумах с аэрируемой водой при температуре 18 ± 2°С не менее 5 сут для пре-адаптации к лабораторным условиям.
В опытах использовали синусоидальное МП. Сигнал создавался в генераторе Г3-102 (Москва) и поступал на кольца Гельмгольца диаметром 0.3 м, в рабочем объеме которых проводились эксперименты. Значения сигнала контролировались с помощью магнитометра НВ0599Б (НПО ЭНТ, Санкт-Петербург) непосредственно перед и после каждой экспозиции. Генерировалось МП с частотой 18.5 Гц и индукцией 44.5 мкТ. Поскольку указанная интенсивность генерируемого МП была максимальной для данной комбинации генератора и пары колец Гельмгольца, мы использовали другую пару колец Гельмгольца (диаметром 0.5 м), подключенную к источнику постоянного тока, чтобы понизить интенсивность геомагнитного поля (следуя принципу суперпозиции магнитных полей) и добиться условий параметрического резонанса в биосистемах (Леднев, 1996) для ионов кальция. Первая пара колец Гельмгольца была размещена в центре второй. Оси обеих пар колец были коллинеарны одна другой, а также геомагнитному полю. В центре экспериментальной установки значение постоянного МП было понижено до 24.2 мкТ. Индукция постоянного МП в экспериментальной установке проверялась с помощью магнитометра НВ0599Б непосредственно перед и после каждой экспозиции.
В эксперименте по изучению влияния МП на кальцийзависимые протеиназы карася in vivo рыбы опытных групп находились в условиях действия низкочастотного МП с заданными параметрами в течение 1 и 2 ч. Животные контрольных групп во время эксперимента находились в условиях постоянного МП Земли. После экспозиции в магнитной установке у рыб ткани скелетных мышц и мозга были взяты для анализа и законсервированы в жидком азоте.
Биохимические исследования были выполнены с использованием оборудования ЦКП ИБ КарНЦ РАН. Была определена общая активность кальпаинов в тканях рыб (Enns, Belcastro, 2006). Образцы тканей гомогенизировали в 20 мМ Tris-HCl-буфере (рН 7.5) с добавлением 150 мМ Nad, 5 мМ натриевой соли этилендиаминтетрауксус-ной кислоты (ЭДТА-Na), 20 мМ дитиотреитола (ДТТ), 0.1%-ного Triton X-100. После центрифугирования (20000 g, 20 мин) в полученном супер-натанте тестировали активность кальпаинов — кальцийзависимую казеинолитическую активность, чувствительную к ингибиторам цистеино-вых протеиназ. Реакционная смесь включала в себя 1 мг/мл щелочно-денатурированного казеина, 20 мМ ДТТ, 200 мкл ферментной фракции и 5 мМ СаС12 (опыт) или ЭДТА-Na (хелатор двухвалентных катионов) (холостая проба) в 50 мМ Tris-HCl-буфере (рН 7.5). После 30-минутной инкубации (28°С) в аликвотах 100 мкл определяли содержание остаточного белка методом Брэдфорд (Bradford, 1976). Единица активности кальпаинов (ЕА)
Таблица 1. Удельная активность кальпаинов в скелетных мышцах и мозге карасей, подвергнутых прижизненному воздействию низкочастотного МП с параметрами резонанса для ионов кальция
Воздействие Удельная активность кальпаинов, ЕА/г белка
мышцы мозг
Контроль 59.58 ± 9.36 135.84 ± 8.83
МП с параметрами резонанса для ионов кальция в течение
1 ч 33.01 ± 7.41* 25.60 ± 8.11**
2 ч 15.02 ± 4.89** 97.37 ± 11.83*
* Отличие от контроля достоверно прир < 0.05. ** Отличие от контроля достоверно прир < 0.01.
определялась как количество фермента, вызывающее увеличение на 0.1 оптического поглощения при 595 нм за 1 ч инкубации при 28°С. Удельную активность кальпаинов определяли в ЕА на 1 г белка.
В эксперименте по изучению in vitro влияния МП на кальцийзависимые протеиназы плотвы инкубацию реакционной смеси, включавшей в себя ферменты, полученные от интактных животных, проводили в стандартных условиях (28°С, 30 мин), при этом опытная серия проб находилась в экспериментальной установке в условиях воздействия МП с заданными параметрами резонанса для ионов кальция, а серия сравнения (контрольные пробы) — в условиях постоянного МП Земли.
Зимографию кальпаинов в 12%-ном полиа-криламидном геле с сополимеризованным казеином (0.2%) проводили методом, описанным ранее (Arthur, Mykles, 2000).
Полученные данные были обработаны с применением общепринятых методов вариационной статистики, с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия U (Коросов, Горбач, 2007).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В конце XX в. была предложена теория, объясняющая механизм действия МП на ионы кальция в клетке. Согласно этой теории первичным звеном в цепи событий, запускаемых воздействием низкочастотного МП на биосистему, являются ионы кальция, связанные со специфичными цен-
12 3
Кальпаин 1
Кальпаин 2
Зимограмма кальцийзависимых протеиназ, выделенных из мышц карасей, подвергнутых прижизненному воздействию МП с заданными параметрами. 1 — контроль; 2 и 3 — МП с параметрами резонанса для ионов кальция (1 и 2 ч соответственно).
трами кальцийсвязывающих белков. При этом воздействие поля приводит к уменьшению константы связывания иона кальция молекулой белка, т.е. снижает время жизни данного иона в кальцийсвязывающих центрах молекулы примерно на порядок (Lednev, 1991; Леднев, 1996).
Опираясь на вышеописанную теорию, мы предположили, что воздействие слабого низкочастотного МП с параметрами резонанса для ионов кальция может привести к изменению сродства протеиназ семейства кальпаинов к основному регулятору их активности (кальцию) и, следовательно, к снижению их активности. Было установлено, что экспериментальное воздействие слабого низкочастотного МП с параметрами резонанса для ионов кальция приводит к снижению активности кальпаинов в мышцах и мозге рыб в условиях как in vivo, так и in vitro. Так, в мышцах карасей, экспонировавшихся в МП с заданными параметрами в течение 1 ч, активность кальпаи-нов снизилась в 1.8 раза по сравнению с контро-
Таблица 2. Удельная активность кальпаинов, выделенных из скелетных мышц и мозга плотвы и подвергнутых воздействию низкочастотного МП с параметрами резонанса для ионов кальция in vitro
Воздействие Удельная активность кальпаинов, ЕА/г белка
мышцы мозг
Контроль 57.81 ± 7.42 210.11 ± 31.02
МП с параметрами резо- 12.15 ± 5.53* 21.13 ± 11.13*
нанса для ионов кальция
* Отличие о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.