УДК 577.151.6:577.24
ВЛИЯНИЕ СОЕВОГО МАСЛА НА АКТИВНОСТЬ ДЫХАТЕЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ В МИТОХОНДРИЯХ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ СТАРЫХ КРЫС
© 2015 г. Г. Е. Бронников1*, Т. П. Кулагина1, А. В. Ариповский2, Л. И. Крамарова3
Институт биофизики клетки, РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3;
*электронная почта:genefrbron@gmail.com 2ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, 142297, Московская обл., Оболенск 3Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3 Поступила в редакцию 03.06.2014 г.
Изучено влияние соевого масла, добавляемого в рацион молодых (6—7 мес.) и старых (26—30 мес.) крыс в течение 6 нед., на активность МАБН-коэнзим Q1-оксидоредуктазы (комплекс I), цитохром-с-оксидазы (комплекс IV) и цитратсинтазы в гомогенатах четырехглавой мышцы бедра. У старых крыс активности комплексов I и IV были значительно ниже, чем у молодых, тогда как активность цитратсинтазы была такой же, как у молодых животных. Соевое масло полностью восстанавливало активность дыхательного комплекса I в мышцах старых крыс, которая становилась такой же, как у молодых особей. При этом активность комплекса IV не изменялась статистически значимо. Жир-нокислотный состав мышечной ткани старых крыс отличался от состава у молодых животных. Введение в рацион старых крыс соевого масла приводило к восстановлению содержания большинства измеренных жирных кислот до уровня молодых особей. Обсуждаются возможные механизмы влияния соевого масла на активность дыхательных комплексов и взаимосвязь между восстановлением активности комплекса I и жирнокислотного состава мышечной ткани.
Ключевые слова: митохондриальные дыхательные комплексы, старение, жирные кислоты, скелетные мышцы, соевое масло.
DOI: 10.7868/S023347551501003X
Исследования последних десятилетий показывают, что нарушения в работе митохондрий играют главную роль в инициации и дальнейшем развитии процесса старения организма. Повреждения митохондрий и, как результат, их пониженная способность производить энергию из различных субстратов, приводят к общему снижению функции ткани. Электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) в мембранах митохондрий образует до 80% активных форм кислорода (АФК), увеличение продукции которых приводит к повреждению белков, липи-дов и митохондриальной ДНК, что снижает активность дыхательных ферментов, существенных для синтеза АТР [1—3]. Недостаток АТР приводит к нарушению функций клеток и стимулирует старение тканей, включая развитие множественных дегенеративных процессов, сахарного диабета второго типа, онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний и ожирение [4—7]. Снижение биоэнергетической способности скелетных мышц сопровождается их атрофией, которая приводит к потере силы мышц и значительному уменьшению
физиологического потенциала мышечной ткани [8, 9]. Причины возрастного снижения уровня биоэнергетики, включая формирование АФК в митохондриях, реконструкцию митохондриальной ДНК привлекают большое внимание. За последнее десятилетие проведен поиск природных соединений, защищающих митохондрии от повреждений [10—12]. Было показано, что введение в рацион старых животных дигидрокверцетина, Х-карнитин-М-ацетилцистеина, коэнзима Q10, оливкового или подсолнечного масла может либо замедлять, либо полностью устранять нарушения в работе митохондрий [11, 13—16]. В данных работах предполагается, что сохранение функций митохондрий и восстановление активности ферментов ЭТЦ может уменьшить возрастные дисфункции тканей и органов и улучшить качество жизни.
Липиды являются интегральной частью структуры митохондриальных дыхательных комплексов [17]. Известно, что жирные кислоты (ЖК), которые входят в состав мембран, могут как снижать, так и увеличивать скорость формирования
АФК, в частности, в митохондриях [18]. Жирно-кислотный состав липидов мембран митохондрий изменяется при добавлении отдельных ЖК, либо их комплексов, входящих в состав растительных масел, вводимых в рацион людей и животных [19—21]. Мы предположили, что добавление масла в пищу старым животным приводит к восстановлению и стабилизации клеточных мембран и улучшению активности дыхательных комплексов в ЭТЦ митохондрий. Опубликованные данные показывают, что митохондриальные комплексы I и IV, а также комплексы II и III у грызунов высокочувствительны к АФК [22—24]. Мы не нашли убедительного подтверждения уменьшений активности комплексов II и III в митохондриях мышц старых крыс. Однако ранее мы наблюдали значительное снижение активности комплексов I и IV в скелетной мускулатуре крыс в возрасте не менее 26—30 мес. [22].
Необходимо отметить, что экспериментальные данные, полученные на митохондриях, выделенных по стандартной методике, оптимизированной для получения высококачественных, но однородных органелл, составляющих только часть общего пула всех митохондрий, не отражали полностью процессов, связанных со старением организма [11, 22].
В данной работе нами продемонстрированы эффекты соевого масла, добавленного в рацион молодых и старых крыс, на активность NADH-коэнзим р1-оксидоредуктазы (комплекс I), ци-тохром-с-оксидазы (комплекс IV) и цитратсинта-зы в гомогенатах четырехглавой мыщцы бедра. Ранее мы показали, что использование гомогена-тов ткани позволяет определить суммарную активность дыхательных ферментов во всех субпопуляциях митохондрий [25].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали крыс линии Spraque-Dawley в возрасте 6—7 мес. (молодые крысы) и 26—30 мес. (старые крысы). Животных содержали в виварии в индивидуальных клетках при естественной продолжительности светового дня и свободном доступе к воде и пище (полнорационный комбикорм, рецепт ПК-120). На протяжении 6 нед. молодые и старые крысы в опыте ежедневно получали 0.5—0.7 мл соевого масла (Sigma, США), добавленного в небольшое количество овсяных хлопьев, заваренных горячей водой. Молодых и старых крыс, которые получали эквивалентную порцию овсяных хлопьев без масла, использовали в качестве контроля. Гомогенат мышечной ткани готовили по методике, описанной ранее [11]. Активность NADH-коэнзим р1-оксидоре-дуктазы (комплекс I), цитохром-с-оксидазы (комплекс IV) и цитратсинтазы определяли спек-трофотометрически в гомогенатах четырехглавой
мышцы бедра согласно [11]. Также мы оценивали чувствительность комплексов I и IV к специфическому ингибитору ротенону и цианиду, которые составили ~70—90 и 97—99% соответственно. Для определения активности ферментов и жирнокис-лотного состава мембран животные были декапи-тированы с предварительным выдерживанием в атмосфере CO2. Четырехглавую мышцу бедра немедленно извлекали, взвешивали и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в буфере, содержащем 120 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 1 мМ ATP, 0.2% BSA, 20 мМ HEPES (pH 7.4). Го-могенаты подвергали ультразвуковой обработке, а затем использовали для определения дыхательных комплексов. Белок определяли по методу Лоури.
Состав ЖК определяли на аналитическом газовом хроматографе GC 3900 (Varian, США) с пламенно-ионизационным детектором (температура 260°C). Готовили гомогенаты четырехглавой мышца бедра в буфере, содержащем ионол (2,6-ди-трет-4-метилфенол), которые затем лиофили-зировали. Метиловые эфиры высших ЖК получали согласно [26] и разделяли на кварцевой капиллярной колонке (15 м х 0.25 мм х 0.3 мкм) с привитой неподвижной фазой SUPELC0WAX-10 (Supelco, Швейцария) в потоке гелия как газа-носителя. Ввод пробы (2 мкл) осуществляли без деления потока газа-носителя; переход к режиму деления проводили через 12—30 с в зависимости от концентрации исследуемых веществ. Температуру колонки поддерживали равной 90°C в течение 0.5 мин, затем увеличивали до 240°C со скоростью 6°С/мин и сохраняли на этом уровне в течение всего эксперимента. Сигнал регистрировали с помощью программы "Мультихром-1.5х" (ЗАОАмперсенд, Россия). Для количественного определения ЖК применяли метод внутреннего стандарта с предварительным вычислением соответствующих калибровочных коэффициентов из хроматограммы смеси определяемых ЖК с маргариновой кислотой.
Для определения активности ферментов и жирнокислотного состава использовали по четыре крысы каждой группы. Ферментативную активность в каждом образце измеряли в 4—6 повторах. Статистическую значимость различий определяли с использованием непарного ¿-критерия Стьюдента или анализа дисперсии (ANOVA).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы изучали эффекты соевого масла, добавленного в рацион молодых и старых крыс, на активность митохондриальных дыхательных комплексов I и IV в гомогенатах четырехглавой мышцы бедра.
Нами показано, что введение соевого масла в рацион молодых животных не влияло статистиче-
50 г
а
£ ю
<D
О
л н о о
к «
и
H
40 -
30 -
20
10
100 Г
Молодые Молодые + соевое масло Старые Старые + соевое масло
KI
KI + ротенон
600 г
g S3 500
ее £ ю
fr ^ е
О-2 л
т
о
о н
«
и т
400 -
300
200 -
100 -
<3
X О н е т
ро 60
л
т
о
о н
«
и
£
е О О Ф
Молодые Молодые + соевое масло Старые Старые + соевое масло
80 -
40
20
Молодые Ц Молодые + соевое масло Старые ■ Старые + соевое масло
Ротенон
г
150 г
а сз
£ к 120
Молодые Молодые + соевое масло Старые Старые + соевое масло
а S
£ ю
90
60
S 30 -
KIV
ЦС
0
0
0
Влияние соевого масла на активность дыхательных комплексов четырехглавой мышцы бедра крыс. а — К I, активность комплекса I в отсутствие специфического ингибитора ротенона; К I + ротенон, активность комплекса I в присутствии ротенона. б — Ротенон, %, ингибирование ротеноном активности комплекса I, выраженное в процентах. в — К IV, активность комплекса IV; г — ЦС, активность цитратсинтазы. Данные представлены как среднее ± SE из четырех независимых экспериментов. Активность комплексов I и IV, цитратсинтазы и эффективность ротенона в мышцах старых крыс сравнивали с активностью ферментов в мышцах молодых крыс и старых крыс, получавших соевое масло. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
ски значимо на активность дыхательных комплексов (рисунок). Добавление соевого масла в рацион старых крыс приводило к полному восстановлению активности комплекса I (рисунок а); Чувствител
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.