ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 5, с. 387-389
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 591.39:57.089.3:575
ВЛИЯНИЕ СОВМЕСТНОЙ МИКРОИНЪЕКЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ И ЭНДОНУКЛЕАЗЫ НА ДОИМПЛАНТАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ ЭМБРИОНОВ МЫШИ in vitro
© 2004 г. М. С. Шишиморова, Л. Б. Иванова, В. П. Рябых
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания
сельскохозяйственных животных 249013 Боровск, Калужская область E-mail: larina@pochtamt.ru Поступила в редакцию 25.06.03 г. Окончательный вариант получен 29.10.03 г.
Изучали влияние совместной микроинъекции генно-инженерной конструкции и сайтспецифичес-кой эндонуклеазы Sali в пронуклеус на доимплантационное развитие эмбрионов мыши (CBA х х C57BL) F1 in vitro. Выживаемость эмбрионов оценивали по их способности развиваться до стадии бластоцисты и вылупляться из блестящей оболочки. Полученные результаты показали, что микроинъекция экзогенной ДНК с эндонуклеазой Sali в концентрации от 0.1 до 0.01 ед/мкл достоверно снижала жизнеспособность эмбрионов по сравнению с контролем (p < 0.05; p < 0.01 соответственно). Однако было установлено, что снижение концентрации эндонуклеазы Sali до 0.01 ед/мкл в инъекционном растворе повышала способность эмбрионов мыши развиваться до стадии бластоцисты и выходить из блестящей оболочки по сравнению с эмбрионами, микроинъецированными раствором экзогенной ДНК с эндонуклеазой Sali в более высокой концентрации.
Ключевые слова: генно-инженерная конструкция, сайтспецифическая эндонуклеаза, микроинъекция, пронуклеус.
Усовершенствование методов трансгенной технологии направлено на повышение частоты интеграции чужеродных генов и обеспечение их эффективной экспрессии в генетически модифицированном организме. Экспериментальные данные свидетельствуют, что наиболее распространенный в настоящее время метод микроинъекции генно-инженерной конструкции в пронуклеус зиготы не обеспечивает высокую эффективность трансгенеза животных (Persuy et al., 1995; Aguerre, Castro-Palomino, 1998).
Современные представления цитогенетики дают основание предполагать, что встраивание чужеродной ДНК происходит в местах естественных разрывов хромосомной ДНК хозяина на ранних стадиях эмбриогенеза (Bishop, Smith, 1989). Одновременное введение рекомбинантной ДНК и сайтспецифичных эндонуклеаз в клетки человека стимулирует гомологичные рекомбинации между чужеродной ДНК и хромосомной ДНК клетки-хозяина (Brenneman et al., 1996). Вследствие этого возникает предположение о том, что совместная микроинъекция в пронуклеусы зигот генной конструкции и эндонуклеазы, с использованием которой осуществлялось отделение данной конструкции от вектора, способствует разрезанию хромосомной ДНК реципиента с образованием липких концов, которые комплементарны липким концам вводимой генно-инженерной конструкции.
Цель данного исследования - изучение влияния совместной микроинъекции генно-инженерной конструкции и рестриктазы в пронуклеус зигот на доимплантационное развитие мышиных эмбрионов in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В работе использовали гибридных мышей (CBA х C57BL) F1. Извлечение зигот проводили путем промывания яйцеводов средой М2, обогащенной 0.4%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА) ("Sigma", США) через 7-8 ч после спаривания.
Генную конструкцию aSIGCSF, содержащую структурный ген гранулоцитколониестимули-рующего фактора человека (hCGSF), ассоциированный с регуляторными последовательностями гена aS1-казеина крупного рогатого скота, отделяли от вектора путем рестрикции рекомбинант-ной плазмиды сайтспецифической эндонуклеазой SalI. Выделенный фрагмент ДНК растворяли в буфере ТЕ до концентрации 5-6 нг/мкл. Непосредственно перед микроинъекцией в раствор с генной конструкцией вносили эндонуклеазу Sali и соответствующий 10-кратный буфер Orange ("Fermentas", США). Микроинъекцию осуществляли на манипуляторе, включающем инвертиро-
387
5*
388 ШИШИМОРОВА и др.
Жизнеспособность эмбрионов мыши, развившихся из зигот, микроинъецированных генной конструкцией aSIGCSF и эндонуклеазой Sali
№ группы Вид микроинъекции в пронуклеус Число зигот Число бластоцист, вылупившихся из блестящей оболочки
общее переживших инъекцию1 дробившихся2 развившихся до бластоцисты
n % n % n % n %
i Контроль(без инъекции) 56 - - 56 100 48 85.7 31 55.4
ii Буфер Orange 48 45 93.7 42 93.5 31* 68.9 19 42.2
iii aSIGCSF 35 31 88.6 29 93.5 21** 67.7 12 38.7
iV aSIGCSF + Sali (0.1 ед/мкл) 59 54 91.5 52 96.3 30*** 55.6 15А 27.8
V То же (0.01 ед/мкл) 52 49 94.2 47 95.9 29*** 59.2 17АА 34.7
Примечания: 1 от общего числа эмбрионов в группе; 2 от числа зигот, переживших инъекцию. Различия по сравнению с контролем между группами достоверны: * 1-11 -р < 0.05; ** 1-Ш -р < 0.01; *** 1-1У, V -р < 0.001; А 1-1У -р < 0.05; " 1-У -р < 0.01.
ванный микроскоп ("Nicon", Япония) с дифференциально-интерференционным контрастом по Номарскому. Культивирование эмбрионов проводили в среде М16 с добавлением 0.5%-но-го БСА в чашках Петри под минеральным маслом ("Sigma", США) в газовой среде, содержащей 5% CO2 в воздухе при температуре 37°C. Критерием оценки жизнеспособности микроинъецированных зигот являлась их способность развиваться до стадии бластоцисты с последующим вылуплением из блестящей оболочки.
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием ¿-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции. Одним из основных условий протекания реакции является состав инкубационной среды. Рекомендуемым буфером для функционирования эндонуклеазы Sali является буфер с высокой ионной силой - Orange, который инъецировали в пронуклеусы зигот в качестве контроля жизнеспособности эмбрионов мыши. Полученные результаты (таблица) свидетельствуют о достоверном снижении способности зигот мыши развиваться до стадии бластоцисты (68.9% (31/45)) и вылупляться из блестящей оболочки (42.2% (19/45)) после инъекции в пронукле-ус буфера Orange по сравнению с группой интактных эмбрионов: 85.7% (48/56) и 55.4% (31/56) (p < 0.05).
Анализируя результаты эксперимента, полученные в результате совместной микроинъекции генной конструкции aSJGCSF и эндонуклеазы Sali в концентрации 0.1 (IV группа) и 0.01 ед/мкл (V группа) в пронуклеус зигот, было отмечено достоверное снижение (p < 0.001) способности зигот развиваться in vitro до стадии бластоцисты и вылупляться из блестящей оболочки по сравнению с контрольной группой (i группа). Так, до стадии
бластоцисты развилось 55.6% (30/54) эмбрионов и вылупилось из блестящей оболочки 27.8% (15/54) после одновременной микроинъекции генно-инженерной конструкции и эндонуклеазы Sali в концентрации 0.1 ед/мкл (TV группа); 59.3% (29/49) эмбрионов достигло стадии бластоцисты и 34.7% (17/49) вылупилось из блестящей оболочки после микроинъекции генно-инженерной конструкции и эндо-нуклеазы Sali в концентрации 0.01 ед/мкл (V группа). Аналогично наблюдалось снижение жизнеспособности эмбрионов указанных выше групп по сравнению с группой эмбрионов, микроинъецированных только генной конструкцией (iii группа).
Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о том, что при снижении концентрации эндонуклеазы Sali с 0.1 (iV группа) до 0.01 ед/мкл (V группа) наблюдалась тенденция повышения способности микроинъецированных зигот развиваться до стадии бластоцисты (p < 0.001).
ОБСУЖДЕНИЕ
Несмотря на значительное количество проведенных исследований, частота интеграции трансгена в геном остается на низком уровне (Krimpenfort et al., 1991; Aguerre et al., 1998). Поскольку механизм интеграции чужеродной нуклеотидной последовательности еще недостаточно изучен, многие исследователи выдвигают свои предположения и гипотезы. Опубликовано предположение о том, что процесс микроинъекции, возможно, катализирует спонтанные хромосомные рекомбинации, и эти функциональные перестройки происходят в сайтах интеграции ДНК (Brinster et al., 1985). Другой автор полагает, что генетические перестройки происходят во время пролиферации клеток либо являются результатом действия агентов, вызывающих изменения последовательности ДНК хозяина (Ward, 1988).
Особый интерес представляет работа авторов, которые исследовали влияние сайтспецифичес-
ОНТОГЕНЕЗ том 35 < 5 2004
ВЛИЯНИЕ СОВМЕСТНОЙ МИКРОИНЪЕКЦИИ
389
ких эндонуклеаз на внутрнхромосомные гомологичные рекомбинации в клетках человека. Показано, что обработка линий клеток человека (Brenneman et al., 1996) эндонуклеазой Xbal, которая распознает сайт внутри гомологичного региона гена гипоксатинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), увеличивала частоту гомологичных рекомбинаций более чем в десять раз.
Исходя из этого возникло предположение, что эн-донуклеаза, инъецированная в пронуклеус вместе с генно-инженерной конструкцией, способна вызвать определенные перестройки в геноме хозяина. На основании этого факта мы применили эндонуклеазу Sail, которую использовали для вырезания генной конструкции aSIGCSF из рекомбинантной плазми-ды.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что микроинъекция буфера Orange в пронуклеус зигот мыши снижает их способность развиваться до стадии бластоцисты и выходить из блестящей оболочки по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с данными других авторов, которые свидетельствуют о том, что инъекция буферных растворов в пронуклеу-сы зигот млекопитающих достоверно снижает их жизнеспособность (Попова и др., 2002).
Большой интерес вызывает работа исследователей, результаты которой показывают, что микроинъекция рестриктазы EcoRI оказала отрицательное воздействие на жизнеспособность зигот и дальнейшее развитие мышиных эмбрионов до стадии бластоцисты. Увеличение концентрации рестриктазы в буферном растворе значительно снизило количество эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты (Seo et al., 2000). Наши данные также показали, что наблюдается аналогичная тенденция снижения жизнеспособности зигот мыши в результате микроинъекции в пронуклеусы зигот смеси генно-инженерной конструкции и эндонуклеазы Sail по сравнению с инъекцией буфера Orange и контролем.
Таким образом, анализ литературных данных и проведе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.