БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 895-901
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.352.4
ВЛИЯНИЕ СПЕР МИНА НА Са2+-ЗАВИСИМУЮ П РОНИЦАЕМОСТЬ
МИТОХОНДРИЙ И ЛИПОСОМ, ИНДУЦИР ОВАННУЮ ПАЛЬМИТИНОВОЙ И а,ю-ГЕКСАДЕКАНДИОЛОВОЙ КИСЛОТАМИ
© 2014 г. К.Н. Белослудцев*, Н.В. Белослудцева*, М.В. Дубинин* **, С.В. Гудков*,
Н.В. Пеньков***, В.Н. Самарцев**
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3; E-mail: bekonik@rambler.ru **Марийский государственный университет, 424001, Йошкар-Ола, площадь Ленина, 1; ***Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3
Поступила в p едакцию 09.06.14 г.
П редставлены данные по влиянию спермина на Са 2+-зависимую проницаемость митохондрий и липосом, индуцированную насыщенными монокарбоновыми и а,ю-диоловыми кислотами. Показано, что спермин дозозависимо ингибировал циклоспорин А-нечувствительное набухание митохондрий, индуцированное пальмитиновой кислотой и Са2+ или а,ю-гексадекандиоловой кислотой и Са2+. Добавление 100 мкМ спермина практически не влияло на дыхание митохондрий в состоянии V2, стимулируемое пальмитиновой кислотой, а,ю-гексадекандиоловой кислотой и Са 2+. В экспериментах на липосомах показано, что добавление 100 мкМ спермина непосредственно к липосомам ингибировало как пальмитат/Са2+-, так и а,ю-гексадекандио-ат/Са-индуцированный выброс флуоресцентного красителя сульфородамина Б. Если же спермин добавляли к липосомам, уже содержащим любую из кислот, то последующая добавка Са2+ приводила к стимуляции выброса красителя. Показано, что добавление спермина к липосомам приводило к значительному увеличению Z-потенциала (с -39,8 мВ до -18,6 мВ). Обсуждается возможный механизм влияния спермина на проницаемость липосом и митохондрий, индуцированную жирными кислотами и С а 2+.
Ключевые слова: митохондрии, липосомы, пальмитиновая кислота, а,т-гексадекандиоловая кислота, кальций, проницаемость мембран.
П риродные полиамины, такие как спермин и спермидин, обладают множеством биологических эффектов: они регулируют ро ст и диф-ференцировку клеток, синтез молекул ДНК и РНК, фосфорилирование белков, участвуют в запуске пр ограммы апоптоза, утилизации свободных радикалов в клетке и др [1-4]. К роме этого, полиамины взаимодействуют с мембра-нами митохондрий и регулируют открытие цик-лоспор ин А-чувствительной митохондриальной поры (МРТ-поры) и транспорт ионов Са2+ в этих органеллах [5-7].
Многообразие функций полиаминов связано с тем, что пр и физиологических значениях рН их молекулы находятся в полностью про -
Сокращения: МРТ-пора - митохондриальная пора (mitochondrial permeability transition pore, пора митохондриаль-ного перехода проницаемости), ЦсА - циклоспорин А, ГДК - а,ю-гексадекандиоловая кислота, ПК - пальмитиновая кислота, CP - сульфородамин Б.
тонированной форме [8], т.е. являются поликатионами. Это позволяет спер мину и другим полиаминам связываться с р азличными класса -ми отрицательно заряженных макромолекул и компонентами мембран, такими как кислые фосфолипиды, свободные жирные кислоты и мембранные белки. Способность полиаминов взаимодействовать с липидным бислоем и белками мембран определяет важную роль этих соединений в регуляции мембранной проницаемости. Экранируя поверхностный заряд мембран, создаваемый отрицательно заряженными липидами и белками, полиамины способны изменять проницаемость биологических и искусственных мембран [7-9].
Ранее мы обнаружили, что свободные насыщенные длинноцепочечные жир ные кислоты способны в присутствии ионов Са2+ индуциро -вать образование липидных пор как в искусственных, так и биологических мембранах [1013]. Было показано, что обр азование таких пор
происходит по механизму хемотропного фазового перехода в результате сегрегации комплексов жирной кислоты с Са2+ в отдельные твер-докр исталлические мембр анные домены [10,14]. Обр азование подобной поры, индуцированной пальмитиновой кислотой и Са 2+, во внутр енней мембране митохондрий приводит к митохонд-риальному набуханию и выбросу проапопто-тических белков из органелл [12,13,15,16]. При этом открытие поры не модулируется известными ингибиторами и активаторами МРТ-поры (циклоспорином А (Ц сА), атрактилозидом, АДФ, неорганическим фосфатом и др.)
[12.13.17]. Установлено, что регуляция пальми-тат/С а2+-индуцированной пор ы может осуществляться либо путем модификации липидного бислоя, либо хелатирующими агентами
[13.17.18]. В связи с этим, спермин как внутриклеточный компонент, способный не только взаимодействовать с мембранами, но и влиять на митохондриальный транспорт Са2+, может быть рассмотрен как пр ир одный регулято р образования пальмитат/Са 2+-индуцир ованной поры в митохондриях.
Недавно было обнаружено, что кроме насыщенных монокарбоновых жирных кислот индукторами С а 2+-зависимой митохондриальной поры, нечувствительной к Ц сА, могут быть и их естественные метаболиты - насыщенные а,ю-диоловые кислоты. Было показано, что набухание митохондрий, индуцированное а,ю-гек-садекандиоловой кислотой (ГДК) и ионами С а2+ так же, как и в случае с монокар боновыми жирными кислотами, не регулируется ингибиторами белковой МРТ-поры [19,20]. Вместе с тем механизм ГДК/Са2+-индуцированной про -ницаемости мембр ан и пути ее регуляции тр е-буют дальнейших исследований. В связи с этим, изучение способности а,ю-диоловых жирных кислот индуцировать С а 2+-зависимую пермеа-билизацию искусственных липидных мембран является важной задачей.
Целью настоящей работы является исследование влияния биогенного полиамина спермина на Са2+-зависимую проницаемость митохондрий и липосом, индуцированную пальмитиновой (ПК) и а,ю-гексадекандиоловой кислотами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Митохондр ии выделяли из печени половозрелых белых беспородных крыс-самцов массой 220-250 г, общепринятым методом дифференциального центрифугирования [12]. Среда выделения содержала 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ НЕРЕ8-КОН (рН 7,4). Полученная суспензия митохондрий
содер жала 90 мг митохондриального белка на 1 мл. Концентрацию митохондриального белка определяли методом Лоури.
Дыхание митохондрий измеряли с помощью кислородного электрода типа Кларк на поля-рографе «Oroboros Оху§гарЬ-2к» (Австрия). Среда инкубации содер жала 120 мМ KCl, 5 мМ NaH2PO4, 5 мМ янтарной кислоты, 5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенона, 1 мкМ Ц сА и 10 мМ HEPES-KOH (рН 7,4). Концентрация митохондриального белка в кювете составляла ~0,5 мг/мл.
Набухание митохондрий регистрировали по изменению поглощения суспензии митохондрий при длине волны 540 нм при постоянном перемешивании и термостатировании пр и 25°С на спектрометрической оптоволоконной оптической системе «Осеап Ор1;^ USB 2000» («Осеап Ор1^, 1пс», США). Ср еда инкубации содержала 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 5 мМ янтарной кислоты, 5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ро-тенона, 1 мкМ ЦсА, 10 мМ HEPES-КОН (рН 7,4). Концентрация митохондриального белка в кювете составляла 0,4 мг/мл. Скор ость набухания митохондрий (Ушах = АЛ 540/мин на 1 мг белка) рассчитывали как изменение поглощения в течение первых 30 с с начала высокоамплитудного набухания. Скорость набухания выражали в процентах. За 100% была принята скоро сть набухания, наблюдаемая при добавлении 15 мкМ ПК и 30 мкМ Са2+ или 20 мкМ ГДК и 30 мкМ Са2+ в серии контрольных экспериментов.
Однослойные липосомы, изготовленные из лецитина, получали методом экструзии в соответствии с описанной ранее методикой [10].
Измерение неспецифической проницаемости липосомальной мембраны оценивалось по выходу из липосом загруженного флуоресцентного кра сителя сульфородамина Б (СР) на спектро -метрической оптоволоконной оптической системе «Осеап Ор11^ USB 2000» («Осеап Ор1^, 1пс», США) (длина волны возбуждения -565 нм; длина волны испускания - 586 нм). Загрузку сульфородамина Б в липосомы про -водили в соответствии с описанной ранее методикой [10]. Инкубационный буфер содержал 80 мМ сахарозы, 50 мМ ЭГТА, 10 мМ трис-Hd ^H 8,5).
Z-потенциал липосом был вычислен исходя из их электрофоретической подвижности, измеренной на прибор е Zetasizer ^по ZS (Ма1уегп Instruments Ltd., Великобритания). Все измер е-ния проводили при 25°С в буфере, содержащем 80 мМ сахарозы, 50 мМ ЭГТА, 10 мМ трис-Hd ^H 8,5).
Р ис. 1. Влияние спер мина на скор о сть митохонд-риального ЦсА-нечувствительного набухания ми-тохондр ий печени кр ыс, индуцир ованного 15 мкМ ПК и 30 мкМ С а2+ (1) или 20 мкМ ГДК и 30 мкМ Са2+ (2). Среда инкубации содержала 210 мМ ман-нитола, 70 мМ сахар озы, 5 мМ янтар ной кислоты, 6 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенона, 10 мМ НЕРЕ8-КОН (рН 7,4). Приведены средние значения ± ошибка средней (п = 4-7).
Рис. 2. С а2+-зависимый выбр о с флуор есцентного кр асителя сульфо р одамина Б из однослойных ли-посом, индуцир ованный ПК (сплошная линия) или ГДК (пунктир ная линия). Со став ср еды: 80 мМ сахар озы, 50 мкМ ЭГТА, 10 мМ тр ис-НС1 (рН 8,5). Добавки: 15 мкМ ПК или 50 мкМ ГДК, 1 мМ С а2+, 0.1% тритона Х-100.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ССЛЕДОВАНИЯ
Влияние спермина на Ц сА-нечувствительное Са2+-зависимое набухание митохондрий, инду-цированное пальмитиновой или а,Ш-гексадекан-диоловой кислотами. На р и с. 1 пр иведены за -висимо сти скор о сти циклоспор ин А -нечувствительного С а2+-зависимого набухания митохон-др ий печени кр ыс, индуцир ованного пальмитиновой (1) или а,ш-гексадекандиоловой кислотами (2) от концентрации добавленного спермина . Из рисунка видно, что спер мин является мощным ингибитор ом митохондриальной Ц сА-нечувствительной поры, индуцированной 15 мкМ пальмитиновой кислоты и 30 мкМ С а2+ (кр ивая 1). Полумаксимальное ингибир о -вание скор о сти набухания наблюдается пр и 80 мкМ спер мина. В то же вр емя спер мин слабее ингибирует набухание митохондр ий, индуцир ованное 20 мкМ ГДК и 30 мкМ Са 2+ (р ис. 1, кр ивая 2). Полумаксимальное ингибир ование
скор о сти набухания в этом случае наблюдается пр и 180 мкМ полиамина.
В табл. 1 представлены данные о влиянии спермина на дыхание митохондрий печени кр ы с. Можно видеть, что добавление 100 мкМ спермина практически не влияло на дыхание митохондрий в состояни
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.