ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 4, с. 394-401
= БИОХИМИЯ
УДК 577.322.75
ВЛИЯНИЕ "СТАРЕНИЯ" МОЛЕКУЛЫ ФИБРИНОГЕНА НА СТРУКТУРУ И СВОЙСТВА ФИБРИНОВОГО ГЕЛЯ
© 2007 г. М. А. Розенфельд, В. Б. Леонова, М. И. Бирюкова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 117334, Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: ibcp@sky.chph.ras.ru Поступила в редакцию 09.10.2005 г.
Исследовалось влияние молекулярного старения фибриногена, стимулированного его предварительной инкубацией в растворе, на пространственную архитектуру фибрина, а также способность последнего к перекрестному сшиванию фибринстабилизирующим фактором и устойчивость фибринового геля к плазминовому гидролизу. Методом упругого светорассеяния показано, что фибрин, образованный из "дефектного" фибриногена, характеризуется более грубой структурой с большим отношением среднемассовой массы к среднемассовой длине полимерных волокон - 22.4 х 108 г/(моль см) по сравнению с нативным фибрином - 14.6 х 108 г/(моль см). Перекрестное сшивание не вносит каких-либо различий в архитектуру как контрольного, так и опытного образцов фибрина. Методами спек-трофотометрии и электрофореза показано, что более "грубые" нековалентно сшитые гели фибрина проявляли повышенную чувствительность к плазмину. Стабилизированные образцы фибрина обнаруживали идентичную толерантность к ферментативному гидролизу. Делается вывод о тесной взаимосвязи спонтанных, локальных конформационных перестроек в молекуле фибриногена и его функциональной активности.
Фибриноген - основной плазменный фактор системы свертывания крови, молекулярная структура которого строго соответствует осуществлению его главной функции: образованию нерастворимого фибрина, являющегося основой тромба. Мультидоменная молекула фибриногена представляет собой димер, в котором половины молекулы ориентированы антипараллельно друг относительно друга и включают набор трех полипептидных цепей: Аа, Вв и у (Blomback, 1996). Центральная часть молекулы, охватывающая NH2-концевые области всех полипептидных цепей, образует центральный домен Е, где содержатся два центра полимеризации (А и 5"knobs"), экранированные фибринопептидами А и В. Домен Е посредством суперспиральных структур связан с двумя периферическими доменами Б, имеющими исходно открытые центры полимеризации (а и 6"^^"), комплементарные центрам в Е-домене. Кроме того, COOH-концевые области Аа-цепей упакованы в аС-домены. Первичным этапом превращения фибриногена в фибрин является отщепление фиб-ринопептидов А от Аа-полипептидных цепей Е-до-мена с экспонированием центров A"knobs", скрепляющих вместе образовавшиеся таким образом молекулы мономерного фибрина за счет взаимодействия с комплементарными участками (а'^^"), локализованными в уС-субдоменах Б-доменов. Б-домен одной молекулы соединяется с центральным Е-доменом другой, а также контактирует по типу "конец к концу" с Б-доменом тре-
тьей, формируя трехдоменный узел "D-E-D". Полимеры имеют структуру двуцепочечных прото-фибрилл, состоящих в среднем из 30 мономерных звеньев (Weisel, 2005). Отщепление фибринопеп-тидов B от Bß-полипепидных цепей E-домена приводит к взаимодействию 5"knobs" с ßC'holes", локализованными в СООН-терминальных сегментах ß-цепей D-домена. Эта реакция является основополагающей в механизме латеральной ассоциации протофибрилл. Наряду с ней определенную роль в этом механизме играют взаимодействия между аС-доменами (Veklich et al., 1993), а также латеральная ассоциация у-цепей в СООН-концевой области и гипотетическая латеральная ассоциация ßC-cубдоменов (Yang et al, 2000; Doolittle, 2003). Стабилизация геля осуществляется путем ферментативного ковалентного сшивания участков у- и частично а-цепей контактирующих молекул мономера, ß-цепи в этом процессе не участвуют (Chen, Doolittle, 1971; Pisano et al., 1971). Розенфельд с соавт. обнаружили, что помимо традиционного полуступенчатого соединения мономеров по типу "конец с серединой" возможен аномальный механизм самосборки молекул мономерного фибрина, вызывающий появление стержневидных, одноцепочечных протофибрилл (Розенфельд и др., 1986, 1988). Эти протофибрил-лы стабилизированы только за счет взаимодействий периферических D-доменов по типу "конец к концу". Анализируя возможные причины возникновения таких аномальных структур, авторы
пришли к выводу о конформационной лабильности молекулы фибриногена, прежде всего в области ее D-доменов, возникающей в результате различных причин, в том числе и при инкубации фибриногена в растворе. Авторы полагают, что молекулярное старение фибриногена обусловлено такими спонтанными, структурными перестройками D-доменов, которые приводят к раскрытию новых центров самосборки. Именно за счет появления таких центров легко обьяснить самопроизвольное формирование одноцепочечных гомополимеров "дефектного" фибриногена, в которых молекулы взаимодействуют между собой СООН-концевыми участками полипептидных цепей только по типу "конец к концу" (Rozenfel'd, Vasil'eva, 1991). На основании этих результатов было высказано также предположение о том, что перекрестному сшиванию подвергаются лишь накапливающиеся со временем "стареющие" молекулы фибриногена, в то время как нативный фибриноген не способен к ферментативной стабилизации XIIIa фактором (Розенфельд и др., 2001; Леонова и др., 2002).
Из вышесказанного ясно, что конформацион-ная подвижность фибриногена не может не влиять на структуру образовывающегося фибринового геля. Структура геля определяется, в конечном счете, соотношением скоростей двух реакций: полимеризации и латеральной агрегации, зависящих от условий их протекания. При увеличении концентраций фибриногена, тромбина, использовании рептилазы, повышении ионной силы растворителя в результате реакции фибринообразования образуются, так называемые, "тонкие" гели, с наличием более длинных и тонких фибрилл и отсутствием больших пространств между волокнами. Для структуры "грубых" гелей характерны относительно короткие и толстые волокна и обширные лакуны, заполненные растворителем (Doolit-tle, 2003). Структура образованного геля влияет не только на его физико-химические свойства (прозрачность, упругость и т.д.), но и на резистентность к ферментативному гидролизу (Collet et al, 2000).
Целью настоящего исследования является получение экспериментальных доказательств влияния молекулярного старения фибриногена на пространственную организацию фибринового геля и, как следствие, на его толерантность к гидролитическому расщеплению под действием плазмина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали бычий фибриноген, полученный из цитратной плазмы крови и дополнительно очищенный от примесей плазминогена и
фибринстабилизирующего фактора, как было описано ранее (Розенфельд и др., 1999).
Лиз-плазминоген был выделен из донорской плазмы крови человека методом аффинной хроматографии на лuзuн-сефарoзе 4В (Deutsch, Mertz, 1970) и активирован стрептокиназой (Behring-werke, Германия). Активность препарата опреде-лась методом Робинса и Самария (Robbins, Summaria, 1970) и составляла 4.8 к.е./мг белка.
Фибринстабилизирующий фактор (XIII фактор) был получен и переведен в активную форму (XIIIa), как было детально описано нами ранее (Розенфельд и др., 2001). Его активность составляла 320 стандартных единиц на мл (ст. ед./мл).
Образование нестабилизированного фибрина проводилось следующим образом: к 2 мл раствора (2 мг/мл) как нативного фибриногена (контроль), так и проинкубированного в течение 2 ч при 25°С (опыт) в буфере (0.05 М триса, 0.15 М NaCl, 5 х 10-3 М CaCl2, pH 7.4) добавляли 0.1 мл раствора тромбина (Roche, Франция) в 0.15 M NaCl, что составляло 5 ед./мл NIH (NIH - National Institutes of Health, USA). Гель формировался за 20-25 с. При постановке фибринолитической реакции к растворам фибриногена (контроль и опыт) одновременно с тромбином вносилось 0.06 мл раствора плазмина (0.8 к.е.) в 0.15 M NaCl. Кинетику реакций фибринообразования и фибринолиза оценивали спектро-фотометрически по изменению оптической плотности (D) при длине волны 350 нм. Реакцию гидролитического расщепления фибрина останавливали соевым ингибитором трипсина (конечная концентрация 0.1 мг/мл) через 0, 15, 45 мин. Образцы анализировали электрофоретическим методом в 5%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0.1% додецил-сульфата-Na и 8 M мочевины.
Перекрестное сшивание фибрина (контроль, опыт) осуществлялось в том же буферном растворе. К 2 мл фибриногена, конечной концентрации 2 мг/мл, добавляли помимо тромбина (см. выше) 0.02 мл (6.4 ст. ед.) XIIIa-фактора. Реакцию останавливали через 0, 15, 45 мин добавлением смеси 8 М мочевины, 2%-ного додецил-сульфата-Na и 5%-ного ß-меркаптоэтанола. Степень перекрестного сшивания полипептидных цепей фибрина определяли методом электрофореза в 7.5%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0.1%-ного додецил-сульфата-Na и 8 M мочевины (Marder et al., 1969).
Измерение упругого светорассеяния белков в растворе проводилось на спектрометре 4400 (Malvern, Англия) с 64-канальным коррелятором К7025 в цилиндрических ячейках, в диапазоне углов рассеяния 0 20°-130°. Источником света служил гелий-неоновый лазер с длиной волны
(c K/R(9)) х 10-8, г/(моль ■ см) 1.8
0.8 1.0
sin(9/2)
Оптическая плотность, D 1.6
10 20 30 40 50 60
Время, мин
3
0
0
Рис. 1. Угловые зависимости интенсивности светорассеяния различных образцов фибриновых гелей: 1 - нестабилизированный фибрин, полученный из на-тивного фибриногена (контроль); 2 - нестабилизированный фибрин, полученный из "дефектного" фибриногена (опыт); 3, 4 - перекрестно сшитые под влиянием фактора ХШа образцы контрольного и опытного фибриновых гелей соответственно.
632.8 нм. Все растворы тщательно обеспыливались путем ультрафильтрации. В качестве стандарта был использован перегнанный бензол, рэле-евское отношение R90 для которого при используемой длине волны принимали равным 8.5 х 10-6 см-1 (Hantgan, Hermans, 1979). Величина инкремента показателя преломления определялась на дифференциальном рефрактометре KMX-16 (Chromatix, USA).
Все эксперименты 10-кратно повторялись. Графики были построены с помощью программы Or
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.