научная статья по теме ВЛИЯНИЕ СТРЕССА НА ОБРАЗОВАНИЕ АНТИБИОТИКОТОЛЕРАНТНЫХ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ СТРЕССА НА ОБРАЗОВАНИЕ АНТИБИОТИКОТОЛЕРАНТНЫХ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ВЛИЯНИЕ СТРЕССА НА ОБРАЗОВАНИЕ АНТИБИОТИКОТОЛЕРАНТНЫХ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI

© 2015 г. Н. Г. Лойко*, А. Н. Козлова*, Ю. А. Николаев*, А. М. Гапонов** ***, А. В. Тутельян** ***, Г. И. Эль-Регистан*

*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва *** Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии

им. Дмитрия Рогачева МЗ РФ, Москва Поступила в редакцию 18.12.2014 г.

В экспериментах in vitro на модели периодической погруженной культуры Escherichia coli К12 выявлено влияние сублетальных доз физических и химических стрессоров (тепловой шок 2 ч, 45°С; внесение в культуру микробного алармона, С12-алкилоксибензола) на развитие устойчивости микробной популяции к последующей летальной антибиотической атаке, а также обнаружена существенная роль временного фактора между этими воздействиями. Период времени: (1) достаточный для развития стрессового ответа, обеспечивает развитие временной адаптивной устойчивости клеток к антибиотической атаке и увеличение числа длительно выживающих клеток-персистеров; (2) меньше времени, необходимого для стрессового ответа, напротив, потенцирует гибель клеток и снижает число персистеров. Установлена гетерогенность выживающих после летального воздействия антибиотика (ампициллина, ципрофлоксацина) фракций (10-4—10-2% от числа КОЕ до воздействия). Фракции включали кроме крайне малой доли антибиотикорезистентных клеток (до 0.005% от числа выживающих), антибиотикотолерантные формы: (1) временно устойчивые метаболически адаптированные клетки, (2) длительно выживающие персистеры и (3) клетки медленно растущих SCV-вариантов (с мелкими колониями, d колоний <1 мм). Предложена гипотеза, рассматривающая персистеры как клетки-предшественники цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) бактерий, в которых пройдена стадия цитодифференцировки, но не завершены процессы клеточного аметаболизма (приобретения состояния анабиоза).

Ключевые слова: Escherichia coli К12, стресс, алкилрезорцин, антибиотикотолерантные клетки, персистеры, адаптивноустойчивые клетки, SCV-варианты, персистеры как предшественники цистопо-добных покоящихся форм.

DOI: 10.7868/S0026365615050146

Выяснение фундаментальных закономерностей лекарственной устойчивости патогенных и условно-патогенных бактерий приобретает все большую актуальность в связи с растущей неэффективностью использования антибиотиков (Gillings, Stokes, 2012; Millar, 2012). Обнаружение в микробных сообществах вечной мерзлоты возрастом сотни тысяч—миллионы лет высокого уровня длительно выживающих (персистирую-щих) клеток, а также генетических детерминант антибиотикоустойчивости и форм их горизонтального переноса привели к выводу, что система адаптивной устойчивости к антибиотикам сформировалась задолго до антропогенного давления (Петрова и соавт., 2012; Shapiro, Dworkin, 1997; van der Woude, 2011).

1 Автор для корреспонденции (e-mail: loikonat@mail.ru).

Продуктивный анализ причинности высокой устойчивости микроорганизмов к повреждающим воздействиям, в том числе антибиотикам, возможен только при рассмотрении микробной популяции как своеобразного многоклеточного саморегулирующегося организма (Shapiro, Dworkin, 1997), основным свойством которого является фенотипическая и генотипическая гетерогенность популяции, обусловливающая выживание организма-популяции при лекарственном и любом другом стрессе (van der Woude, 2011).

С учетом этих положений рассмотрим основные стратегии выживания популяции при антибиотической атаке. Первая из них обеспечена наличием и экспрессией генов, отвечающих за изменения мишеней для антибиотиков, эффективный выброс антибиотиков из клеток эффлюкс-система-ми, модификацию или деструкцию молекул анти-

биотиков и др. (Guilfoile, Alcamo, 2007). Такие наследуемые генотипы антибиотикорезистентности обусловливают активное сопротивление клеток к конкретному лекарственному препарату и возможность деления клеток в его присутствии (Guilfoile, Alcamo, 2007; Grassi, Grilli, 2012; Petrova et al., 2011). При пересеве в свежую среду они вырастают популяцией таких же генотипически антибиотикорезистент-ных клеток.

Другая эволюционно выработанная стратегия выживания бактерий в присутствии бактерицидных доз антибиотика реализуется за счет процессов ци-тодифференцировки, приводящей к изменению фенотипа, задержки роста клеток с выходом из клеточного цикла и выключению мишеней для антибиотиков (Gefen, Balaban, 2008; Lewis, 2010; Kint et al., 2012; Balaban et al., 2013). За счет такого ненаследуемого пассивного механизма — анти-биотикотолерантности, клетки сохраняют жизнеспособность в присутствии антибиотиков, хотя и не делятся. При переносе в свежую среду такие клетки воспроизводят популяцию, подобную родительской, в которой большинство клеток чувствительны к антибиотикам, но при этом вновь образуется малое число антибиотикотолерантных клеток (Gefen, Balaban, 2008; Lewis, 2010; Kint et. al., 2012; Balaban et. al., 2013). Такие антибиотикото-лерантные формы были в 1944 г. названы Бигге-ром персистерами (П) (Bigger, 1944).

В настоящее время различают два типа перси-стеров: образующиеся в растущей культуре (в фазе экспоненциального — замедленного роста) персистеры II типа (ПП), численностью около 0.01%, и образующиеся в стационарной культуре персистеры I типа (П1), численностью до 1% и более (Balaban et al., 2004; Shan et al., 2006).

Другим фенотипом толерантности обладают так называемые индифферентные клетки, физиологическое состояние которых свойственно клеткам культур стационарной фазы (Levin, Rozen, 2006). Выход из клеточного цикла обусловливает их временную способность выживать в присутствии антибиотиков. В отличие от персистеров, они чувствительны к антибиотикам хинолоново-го ряда (в т.ч. ципрофлоксацину) (Grant, Hung, 2013). Так как стационарная фаза ассоциируется и с индифферентными клетками и персистерами I типа, важно различать эти формы толерантности. Еще одной формой временной толерантности бактерий к антибиотикам является метаболическая адаптивная устойчивость, связанная, в том числе, с изменением проницаемости клеточных оболочек (Fernandez, Hancock, 2012). Также к ан-тибиотикотолерантным формам относят клетки SCV-фенотипа, образующие очень мелкие колонии (d < 1 мм), крайне медленно растущие и, вследствие этого, устойчивые к антибиотикам

(Grant, Hung, 2013). Из всех форм антибиотико-устойчивости наибольшее внимание в настоящее время уделяется персистерам, поскольку они выживают в присутствии любых антибиотиков (антимикробных препаратов), образуются как фенотип выживания и в популяциях антибиотикорези-стентных клонов и, как считается, ответственны за рецидивы хронических инфекций. Следует подчеркнуть, что персистеры образуются в развивающейся культуре всегда, вне зависимости от наличия антибиотиков, которые являются лишь селектирующим фактором, выделяющим персистеры из общей массы чувствительных к антибиотикам и потому лизирующихся клеток.

Имеется информация о позитивном влиянии на образование толерантных клеток (переход фенотипа обычного в толерантный) неблагоприятных условий роста культур: лимита источника азота, обусловливающего голодание (Nguyen et al., 2011), или гипоксии и низкого рН (Wayne, Lin, 1982). Относительно связи общего стрессового ответа популяции с развитием разных форм анти-биотикотолерантности клеток информации практически нет. При этом остается неопределенной дальнейшая судьба клеток-персистеров в ситуации продолжающихся неростовых условий (в среде с антибиотиком).

Целью настоящей работы было исследовать влияние стресса, вызванного тепловым шоком или внесением в культуру микробного алармона, на развитие и тип антибиотикотолерантности клеток E. coli K12; гетерогенность выживающей при воздействии антибиотика субпопуляции; а также определить характеристики клеток, выживших после длительной экспозиции (30 сут) к антибиотику.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования была грамотрицатель-ная бактерия Escherichia coli К12 из коллекции НИИ новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН.

Культивирование. Бактерии выращивали в среде Луриа-Бертани (LB Broth, Miller) следующего состава (г/л): дрожжевой автолизат — 10.0; пептон — 5.0; NaCl — 5; pH среды 7.0. Инокулят — культуру начала стационарной фазы (20 ч) вносили в количестве, которое обеспечивало начальную численность опытной культуры 8.0 х 107 кл/мл. Аликвоты опытной культуры (1 мл) переносили в эппендорфы объемом 2 мл. Культивирование осуществляли при перемешивании на термошейкере (BIOSAN TS-100) при 700 об./мин и температуре 28°С.

Выявление антибиотикотолерантных клеток-персистеров II типа осуществляли модифицированным методом Keren (Keren et al., 2004). Бактерии Е. coli К12 опытного и контрольного вариантов выращивали, как описано выше, до фазы

экспоненциального роста. Затем в опытные пробирки вносили антибиотик ампициллин (Амп) или ципрофлоксацин (Цип) в концентрациях 30 или 100 мкг/мл и продолжали инкубировать на термошейкере в тех же условиях. В контрольные культуры добавляли эквивалентное количество дистиллированной воды. Для определения численности жизнеспособных клеток в опытных или контрольных (без внесения антибиотика) вариантах отбирали необходимое количество эппендор-фов, клетки в них осаждали центрифугированием (10000 g, 5 мин), промывали физиологическим раствором (0.9% NaCl) дважды. Осадок клеток ресус-пендировали в 1 мл физиологического раствора и использовали для определения числа КОЕ на ага-ризованной среде LB с или без антибиотика Амп (10 мкг/мл).

Выявление антибиотикотолерантных клеток, образующихся под влиянием теплового шока. Бактерии Е. coli К12 выращивали как описано выше до фазы экспоненциального роста (КОЕ = 5.3 х х 108 кл/мл). В контрольные варианты в пробирки вносили антибиотик ампициллин (Амп) в концентрации 0, 10, 30, 60, 100 мкг/мл, после чего продолжали культивирование на термошейкере (700 об./мин; 28°C). В опытных вариантах культуры в эппендорфах в течение 2 ч подвергали сублетальному воздействию температ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»