УДК 576.314:576.524:57.043
ВЛИЯНИЕ СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЙ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ НА ПОВЕРХНОСТНЫЙ МАРКЕР CD44 ЭРИТРОЦИТОВ © 2014 г. Н. Г. Землянских*, Л. А. Бабийчук
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Украина, 61015, Харьков, ул. Переяславская, 23; *электронная почта: nina_zemlya@mail.ru Поступила в редакцию 28.04.2014 г.
Изучение изменений поверхностных маркерных структур под действием стрессов, сопряженных, в частности, с криоконсервированием, может быть важным для понимания механизмов, ответственных за стабилизацию или повреждение клеток в экстремальных условиях. Цель представленной работы состояла в определении изменений параметров распределения маркера СБ44 в эритроцитах, экспонированных в средах эндо- и экзоцеллюлярного криопротекторов (глицерин и ПЭГ-1500), а также в оценке влияния процессов замораживания-отогрева и отмывки клеток от криопротектора на данный маркер. Криопротекторы глицерин (2 М (18.5%)) и ПЭГ-1500 (0.133 М (20%)) только при пролонгированной экспозиции (20 ч) вызывали изменения в мембрано-цитоскелетном комплексе эритроцитов и сопровождались снижением количества СБ44-позитивных клеток. Глицерин вызывал в эритроцитах небольшое, но значимое снижение экспрессии СБ44, что не наблюдали в присутствии ПЭГ-1500. После кратковременной экспозиции размороженных эритроцитов при физиологической температуре существенно снижалась экспрессия маркера и количество СБ44-позитивных клеток. В криоконсервированных эритроцитах эти изменения были в большей степени выражены в присутствии ПЭГ-1500, чем глицерина. Различия во времени обнаружения изменений параметров распределения СБ44 в криоконвервированных эритроцитах и в эритроцитах, экспонированных в растворах криопротекторов, указывают на принципиальные отличия в причинах, их вызвавших. Удаление криопротекторов, сопровождаемое потерей части клеток в процессе отмывки, приводило к восстановлению характеристик распределения СБ44 в суспензии криоконсервированных эритроцитов. При ги-потермическом хранении размороженных эритроцитов в присутствии криопротекторов выявленные тенденции в целом сохранялись. При гипотермическом хранении размороженных и отмытых от криопротекторов эритроцитов параметры СБ44 не отличались от контрольных значений. Полученные результаты указывают на то, что эти изменения охватывают только часть клеток в суспензии и ассоциируются с нестабильностью популяции эритроцитов с измененными характеристиками СБ44.
Ключевые слова: мембрана, поверхностный маркер, СБ44, эритроцит, криоконсервирование.
Б01: 10.7868/80233475514050107
ВВЕДЕНИЕ
Мембраны эритроцитов содержат различные белки, выполняющие структурные, транспортные, рецепторные и регуляторные функции. Практически все белки гликозилированы. Глика-ны вместе с внеклеточными фрагментами белков образуют специфические поверхностные маркеры. Поверхностный маркер СЭ44 представляет собой трансмембранную молекулу адгезии, основным лигандом которой является гиалуроно-вая кислота [1]. СЭ44 может взаимодействовать и с другими компонентами внеклеточного матрикса, в частности, с ламинином, фибронектином, сульфатом гепарина и коллагенами типа I и IV [1—3]. Этот маркер характеризуется определенной тка-неспецифичностью и представлен несколькими
изоформами, которые отличаются рядом свойств [1]. Эритроциты содержат стандартную изоформу СВ44—СЭ448 [4], называемую также гемопоэти-ческой (СЭ44Н). Молекулярная масса СЭ448 может колебаться в зависимости от степени глико-зилирования и составляет в среднем 80—95 кДа, при этом на пептидную часть молекулы приходится примерно 40 кДа [5]. СЭ448 состоит из 341 аминокислотного остатка, из которых 248 входят в состав внеклеточного домена. Ряд аминокислотных остатков внеклеточного домена подвергаются гликозилированию с образованием О- и М-гликозидных связей.
СЭ44 в эритроцитах представляет несколько антигенов групп крови, которые относятся к системам 1п а/Ь (Ьи) и Ап^] [6]. Антигены системы
групп крови AnWj находятся в проксимальном участке внеклеточного домена молекулы СЭ44 и относятся к антигенам с высоким показателем распространенности. Эти антигены формируют рецепторы для Haemophilus influenzae, возбудителя острой бактериальной инфекции. Антигены системы групп крови In a/b (Lu) находятся в ди-стальном участке молекулы СЭ44, в домене, связывающем гиалуроновую кислоту. У подавляющего большинства людей экспрессируется антиген In(b). В гомозиготной форме антиген In(a) экспрессируется крайне редко и ассоциирован с выработкой антител при переливании крови и беременности [2].
Роль СЭ44 в эритроцитах до конца не установлена, но предполагается, что он может участвовать в межклеточной сигнализации, способствуя стимуляции других клеток, в том числе лимфоцитов или моноцитов [7, 8]. Таким образом, маркер эритроцитов СЭ44 может выполнять определенные вспомогательные функции в иммунном ответе и воспалительных реакциях, способствуя удалению из организма чужеродных объектов и апо-птозных клеток. Показано также, что СЭ44 может отвечать за прикрепление и продвижение эритроцитов по синтетическому субстрату в условиях сдвига [9]. Кроме того, адгезионные свойства эритроцитов, опосредованные различными молекулами, в том числе СЭ44, вовлечены в развитие патофизиологических процессов, связанных с вазоокклюзивными состояниями, при сер-повидноклеточной анемии, наследственном сфе-роцитозе и других заболеваниях [10].
Известно, что СЭ44 участвует в формировании связей с цитоскелетом эритроцитов и, возможно, играет определенную роль в модуляции механоэластических свойств мембраны. Это косвенно подтверждается, в частности, тем, что в случае генетической модификации, приводящей к полной потере белка полосы 4.2 в эритроцитах, и сопровождаемой более высокой экспрессией данного поверхностного маркера, повышается ассоциация СЭ44 с цитоскелетом и проявляется относительно легкий фенотип анемии [11].
Изменения в состоянии поверхностных маркеров ассоциированы с процессами старения клеток in vivo и in vitro [12—16]. Следовательно, изучение изменений поверхностных маркерных структур клеточных мембран, вызванных стрессовыми факторами, сопряженными, в частности, с криоконсервированием, важны для понимания механизмов, ответственных за стабилизацию или повреждение клеток в экстремальных условиях. При низкотемпературных воздействиях для защиты клеток используют эндо- и экзоцеллюляр-ные криопротекторы, которые реализуют защитные свойства, проникая в клетки или оставаясь во внеклеточной среде. В обоих случаях криопро-
текторы вызывают структурные и функциональные изменения в клетках. При замораживании эритроцитов успешно применяется глицерин, который относят к эндоцеллюлярным криопротек-торам. Он гарантирует высокую сохранность клеток в процессе криоконсервирования как при —80°С [17, 18], так и более низких температурах, обеспечиваемых жидким азотом (до —196° С) [18]. Однако использование эндоцеллюлярного крио-протектора предполагает удаление криопротек-тора из клеток после размораживания, что требует дополнительных затрат. Поэтому изучение различных экзоцеллюлярных соединений, которые позволили бы применять криоконсервированные клетки без отмывания, представляет значительный интерес для практики криоконсервирования клеточных суспензий. В случае эритроцитов перспективным экзоцеллюлярным криопротектром может быть ПЭГ-1500.
Цель данной работы состояла в изучении параметров распределения поверхностного маркера СЭ44 в эритроцитах, экспонированных в средах эндо- и экзоцеллюлярного криопротекторов (глицерина и ПЭГ-1500), а также в оценке влияния процессов замораживания—отогрева и отмывки клеток от криопротекторов на данный маркер.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы следующие реактивы: CD44-FITC (BD Biosciences), Трис, HEPES (Sigma, США), бычий сывороточный альбумин (БСА) (PAA Laboratories GmbH, Австрия), глюкоза и полиэтиленгликоль м.м. 1500 (ПЭГ-1500) (Fluka, США), а также глицерин и соли производства России и Украины (х. ч. или ч. д. а.). Препарат CD44-FITC (BD Biosciences) представляет собой моноклональные антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем FITC, которые специфически связываются с поверхностным мембранным маркером CD44. В соответствии с международной номенклатурой эти антитела названы так же, как поверхностные мембранные молекулы, для идентификации которых они предназначены - CD44-FITC.
Объектом исследования служили эритроциты крови доноров, заготовленной с использованием глюкозо-цитратного раствора в центре крови г. Харькова. Эритроциты осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин (ОПН-3) при комнатной температуре, удаляли плазму и лейкоцитарные компоненты крови. Затем к осажденным эритроцитам добавляли раствор 150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 7.4 в объеме в 5 раз превышающем объем клеточной массы и отмывали от остатков плазмы и белых клеток трехкратным центрифугированием в аналогичном режиме.
Плотноупакованные эритроциты (50 мкл) суспендировали в 500 мкл растворов криопротектор-ных соединений. Конечный гематокрит клеточных суспензий составлял около 10%. В работе использовали растворы: 2 М (18.5%)) глицерин и 0.133 М (20%) ПЭГ-1500, дополненные 150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 7.4. В качестве контроля использовали модифицированную среду Рингера: 125 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 32 мМ HEPES (pH 7.4), 5 мМ глюкоза, 0.5% БСА. Клетки инкубировали в течение 20 ч при 37оС. Затем клеточные суспензии разводили в соответствующих растворах до концентрации порядка 107 клеток/мл. К 50 мкл разведенных клеточных суспензий добавляли 15 мкл препарата CD44-FITC и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Затем в клеточные суспензии добавляли 435 мкл соответствующих сред, снижая концентрацию эритроцитов примерно до 106 клеток/мл, и оценивали связывание эритроцитами препарата CD44-FITC методом проточной цитометрии на приборе FACS Calibur (Becton Dickenson, США). В каждом измерении просчитывали 30000 событий. Данные анализировали с помощью программы WinMDI 2.8.
Для оценки изменений параметров поверхностного маркера CD44 под влияни
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.