ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 5, с. 531-534
УДК 541.64:547.96
ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ГИДРОГЕЛЕВЫХ НОСИТЕЛЕЙ НА АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ТРИПСИНА
© 2015 г. Л. И. Валуев*, И. Л. Валуев*, Л. В. Ванчугова*, Т. А. Валуева**
*Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН, Москва 119991 **Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва 119071 e-mail: valuev@ips.ac.ru Поступила в редакцию 11.02.2015 г.
Исследована зависимость активности трипсина, иммобилизованного в полиакриламидном гидрогеле, от степени набухания гидрогеля, распределения его пор по размерам и способа связывания с ним фермента. Показано, что наиболее благоприятные условия для функционирования иммобилизованного трипсина обеспечивало его связывание с гидрогелем путем сополимеризации макромономера трипсина с акриламидом и сшивающим агентом в присутствии модификатора, ограничивающего рост полимерных цепей.
Ключевые слова: трипсин, иммобилизация, полиакриламидный гидрогель. DOI: 10.7868/S0555109915050177
Интерес к биологически активным соединениям, иммобилизованным в полимерных гидрогелях, обусловлен, в первую очередь, их уникальными возможностями для решения ряда прикладных задач, например, создания активных каталитических систем или аффинных сорбентов, используемых для получения высокоочищенных биопрепаратов. При создании таких материалов возникает вопрос о выборе подходящего полимера-носителя и способа присоединения белка к этому носителю. В работах, посвященных решению подобных задач, а количество таких работ в последние годы возрастает лавинообразно [1—5], гидрогели обычно рассматриваются как носители, основная функция которых заключается в присоединении белка и перевода его в нерастворимое состояние. При этом роль физической структуры гидрогеля, а также способа связывания белка с носителем в проявлении активности иммобилизованного соединения практически не обсуждается.
Цель работы — сравнительное изучение активности белка (трипсина), иммобилизованного в полиакриламидном гидрогеле (ПААГ) двумя принципиально различными методами: связывание фермента с готовым гидрогелем (ПААГ-А) и связывание с гидрогелем на стадии его образования (ПААГ-Б), а также изучение зависимости активности иммобилизованного трипсина от физической структуры полимера-носителя.
МЕТОДИКА
В работе использовали акриламид, М,№-мети-ленбисакриламид (БИС), персульфат аммония (ПА)
и М,М,№,№-тетраметилэтилендиамин (ТМЭД), хлорангидрид акриловой кислоты (ХАК), меркап-тоуксусную кислоту (МУК) ("Serva", Германия), инсулин (молекулярная масса, ММ, 6500 Да), апротинин, трипсин (КФ 3.4.21.4, "Sigma", США) и белки-маркеры молекулярной массы ("Pharmacia", Швеция): яичный альбумин (43000 Да), бычий сывороточный альбумин (67000 Да), лактат дегидрогеназа (140000 Да) и альдолаза (158000 Да). Овомукоид выделяли из белка утиных яиц по методу [6]. Акрилоил-М-гидроксифталимид (АГФИ) синтезировали по методу [7].
ПААГ синтезировали двумя методами. Для получения ПААГ-1-А смешивали раствор 100 мг АГФИ и 0.25 мл ТМЭД в 5 мл этанола с раствором 4.0 г акриламида, 0.08 г БИС и 0.05 г ПА в 50 мл бидистиллированной воды. Смесь инкубировали в течение 2—3 ч при комнатной температуре. Образующийся гидрогель промывали водой. ПААГ-11-А получали аналогичным методом, но в присутствии 0.05 г МУК.
Для иммобилизации трипсина 10 г каждого гидрогеля инкубировали в 50 мл раствора трипсина (2.0 мг/мл) в 0.5 М трис-HCl буфере, pH 8.0, содержащего 0.1 М NaCl и 0.02 М CaCl2, в течение 5 ч при комнатной температуре. Содержание иммобилизованного трипсина (равное 2.7 ± 0.3 мг белка/г гидрогеля) рассчитывали по количеству не связавшегося с носителем белка.
Для получения макромономера трипсина в 50 мл раствора фермента (3.5 мг/мл) в 0.5 М би-карбонатном буфере, рН 8.0, вносили 0.3 мл ХАК,
Свойства гидрогелей, содержащих иммобилизованный трипсин
ПААГ Sr ± 0.8 Доступность для молекул с ММ х 103 Да, % ±6 Емкость сорбента, мг ингибитора/мг трипсина ±0.03
6.5 43 67 140 158 апротинин овомукоид
I-А II-А I-Б II-Б 11.2 24.3 16.4 27.8 76 83 85 87 71 81 77 75 68 75 66 68 50 30 41 25 50 31 40 25 0.13 0.19 0.18 0.24 0.56 0.64 0.89 1.03
затем смесь инкубировали при перемешивании в течение 60 мин при 0°C,
Для получения гидрогеля ПААГ-1-Б к 50 мл раствора макромономера трипсина добавляли 4.0 г акриламида, 0.08 г БИС, 0.05 г ПА и 0.25 мл ТМЭД и инкубировали в течение 2—3 ч при комнатной температуре. Образующейся гидрогель промывали водой.
Гидрогель ПААГ-11-Б получали аналогичным методом, но в присутствии 0.05 г МУК. Содержание иммобилизованного трипсина как в ПААГ-1-Б, так и ПААГ-11-Б составляло 2.2 ± 0.3 мг/г гидрогеля.
Белок определяли спектрофотометрическим методом при 280 нм, связанный белок (трипсин) после удаления с сорбента 0.1 М HCl, рН 1.0.
Степень набухания гидрогелей оценивали гравиметрически и рассчитывали по формуле: ST = = m1/m2 — 1, где m1 и m2 — массы равновесно набухшего и лиофильно высушенного гидрогеля соответственно.
Для изучения проницаемости гидрогелей набухший в воде гель измельчали с помощью механического пресса через сито с диаметром пор 1 мм. К 2 мл геля добавляли 4 мл раствора белка. Смесь инкубировали при 4°С до установления постоянного значения оптической плотности раствора белка, которую измеряли на спектрофотометре Hitachi-3410 (Япония) при 280 нм (обычно время инкубации составляло не более 12 ч). Концентрацию белка в исходном растворе и в растворе после инкубации с гелем определяли, используя калибровочную кривую, построенную для каждого белка.
Количество пор, доступных для каждого белка, рассчитывали по соотношению объемов гидрогеля и раствора белка, принимая за 100% количество пор, доступных для воды.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для синтеза гидрогелей, содержащих иммобилизованный трипсин, были использованы два принципиально различных подхода. Первый из них (А) заключался в иммобилизации белка в объеме активированного ПААГ, который получали сополимеризацией акриламида с БИС и АГФИ
(ПААГ-1-А). Реакция иммобилизации фермента протекала по схеме:
ТРИПСИН-NH;, + ГИДРОГЕЛЬ— CH-CH2---
CO
I
O N
OC CO
ГИДРОГЕЛЬ - CH— CH
I
2
со
кн-трипсин
Второй подход включал иммобилизацию трипсина на стадии формирования гидрогеля. Сначала реакцией с ХАК синтезировали ненасыщенное производное фермента (макромономер):
ТРИПСИН-КН2 + СН2=СНСОС1 ^ ^ ТРИПСИН-ЫН-СО-СН=СН2,
который затем сополимеризовали с акриламидом в присутствии БИС, ПА и ТМЭД (ПААГ-1-Б).
На первой стадии синтеза обоих гидрогелей образовывались растворимые полимеры, которые затем сшивались в единую сетку. Гидрогели (ПААГ-11-А и ПААГ-11-Б) были синтезированы в присутствии МУК, которая ограничивает рост полимерных цепей при полимеризации и предотвращает образование пор большого размера [8].
Основные характеристики синтезированных гидрогелей, приведены в таблице.
Из таблицы видно, что, во-первых, ПААГ-11-А и ПААГ-11-Б, полученные с участием макромономера трипсина, имели более высокую степень набухания по сравнению с ПААГ-1-А и ПААГ-1-Б, синтезированными в отсутствии макромономера, а, во-вторых, они характеризовались снижением количества пор большого размера, проницаемых для молекул белков с молекулярными массами выше 140000 Да. Эти эффекты обусловлены, по всей вероятности, особенностями сшивания сополимеров акриламида и макромономера, при котором часть звеньев макромономера концентрировалась на поверхности пор и препятствовала об-
ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ГИДРОГЕЛЕВЫХ НОСИТЕЛЕЙ
533
разованию толстых стенок, разделяющих эти поры [9]. В большей степени модифицирующее действие на структуру гидрогелей оказывала меркап-тоуксусная кислота. У ПААГ-11-А и ПААГ-11-Б почти в два раза увеличивалась степень набухания и значительно уменьшалось количество больших пор. В присутствии МУК ограничивался рост полимерных цепей при полимеризации, что препятствовало образованию пор большого размера. Аналогичное влияние МУК на структуру гидрогеля наблюдали ранее при синтезе модифицированного гемосорбента ("Овосорб"), содержащего иммобилизованный ингибитор протеиназ [10].
Изменение структуры гидрогелей сопровождалось изменением способности иммобилизованного трипсина взаимодействовать с его природными ингибиторами. Так, одна молекула на-тивного трипсина с ММ 24000 Да может связать одну молекулу апротинина с ММ 6500 Да или одну молекулу овомукоида с ММ 31000 Да. В том случае, когда все молекулы иммобилизованного трипсина доступны для молекул ингибиторов, 1 мг иммобилизованного трипсина был бы способен связать 0.27 мг апротинина или 1.29 мг овомукоида. Данные, приведенные в таблице, указывают на то, что использование МУК при синтезе ПААГ-А позволило повысить с 48 до 70% количество иммобилизованного трипсина, доступного для связывания с апротинином, и с 43 до 50% — для связывания с более высокомолекулярным овомукоидом. В гидрогелях ПААГ-Б, полученных с участием макромономера трипсина, количество иммобилизованного фермента, доступного для связывания как апротинина, так и овомуко-ида составляло около 80%. Таким образом, наивысшей емкостью по отношению к обоим ингибиторам обладал гидрогель ПААГ-11-Б с максимальной степенью набухания и минимальным содержанием пор большого размера. Можно предположить, что мелкопористый гидрогель ПААГ-11-Б имел наиболее развитую поверхность, и большая часть молекул трипсина (порядка 80% от общего количества) локализовалась на поверхности стенок, разделяющих поры. Это позволило молекулам ингибитора, имеющим как низкую, так и относительно высокую молекулярную массу, эффективно связываться с молекулами трипсина.
Неожиданные результаты были получены при изучении кинетики взаимодействия природных ингибиторов с синтезированными гидрогелями. На рисунке приведена кинетика взаимодействия апротинина с иммобилизованным трипсином. Видно, что наиболее высокой скоростью взаимодействия характеризовался гидрогель с наименьшим содержанием пор большого размера. Так, через 45 мин иммобилизованный в этом гидрогеле фермент связывал почти 90% ингибитора от максимально возможного. Аналогичная зависимость была обнаружена при изучении к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.