ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 4, с. 382-390
УДК 547.92
ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ СТЕРОИДНОЙ МОЛЕКУЛЫ НА НАПРАВЛЕНИЕ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ГРИБОМ Curvularia lunata
© 2013 г. В. А. Андрюшина, В. В. Ядерец, Т. С. Стыценко, А. В. Дружинина, Н. Е. Войшвилло
Центр "Биоинженерия"РАН, Москва, 117312 e-mail: andryushina@rambler.ru Поступила в редакцию 08.11.2012 г.
Идентифицированы с помощью Н1ПМР -спектроскопии, а также сравнением со стандартными образцами, основные и побочные продукты гидроксилирования мицелием C. lunata ВКПМ F-981 четырнадцати Д4-3-кетостероидов рядов эстрана, андростана и прегнана и шести их Д5-3Р-гидрокси-аналогов. Полученные экспериментальные данные рассмотрены с точки зрения триангулярной модели субстрат-ферментного взаимодействия.
Выявлена зависимость направления гидроксилирования стероидной молекулы и ориентации гид-роксигрупп от структуры исходного субстрата.
Б01: 10.7868/8055510991304003Х
За период, прошедший после сообщения [1] в 1952 г. Петерсоном и Мюрреем о наличии у плесневого гриба ЕН^орыз arrhizus способности осуществлять 11а-гидроксилирование стероидов, была осуществлена микробная трансформация соединений ряда эстрана, андростана и прегнана. Было установлено, что микроскопические грибы всех классов могут вводить гидроксигруппы почти во все положения стероидной молекулы, причем более 300 штаммов проявляют способность к 7а- и 11а-гидроксилированию. Около 100 видов образуют смесь 11а- и 11р-гидроксисоединений, однако только единицы способны селективно вводить гидроксигруппы в 8р- и 11р-положения, доступ к которым, возможно, затруднен 18Р- и 19Р-метильными группами [2—8].
Вводить в стероиды 11р-гидроксигруппу способны штаммы рода Сигуи1аИа, в частности вид С. 1ипа1а, с помощью которого получен большой набор 11р-гидроксистероидов ряда андростана, прегнана и эстрана [3—6, 9—15]. Особенность гриба С. 1ипа1а заключается в осуществлении, главным образом, аксиального гидроксилирования. В зависимости от структуры Д4-3-кетостероидов С. 1ипа1а преимущественно вводит гидроксигруппы в 11Р- или 14а-, а также в 9а-положения молекулы. Побочные гидроксисоединения могут появляться вследствие 6Р- и 7а-гидроксилирования, а также восстановления 17- и 20-кетогрупп [2—6].
Несмотря на большое количество данных по трансформации различных стероидов микроорганизмами, зависимость между строением стероидной молекулы и направлением ее гидроксилирования еще недостаточно изучена. Группой ученых
Оксфордского университета под руководством проф. Джонса на примере 5а-андростанов была разработана триангулярная модель субстрат-ферментного взаимодействия [16], основанная на предположении о том, что гидроксилирование стероидного субстрата в различные положения осуществляется одним и тем же ферментом [17].
Согласно этой модели, кислородные группы стероида при С3 и С17 (или С20) выполняют функцию связывания стероидного субстрата с ферментом, а направление вводимой в молекулу гидроксигруппы зависит от ориентации стероида по отношению к ферменту. Рассматриваются 4 теоретически возможные ориентации: A — нормальная (normal), B — нормальная перевернутая (normal inverted), C — альтернативная (reverse), D — альтернативная перевернутая (reverse inverted) (рис. 1). Ориентации А и С могут быть получены друг из друга вращением молекулы вокруг оси, перпендикулярной плоскости ее колец, а ориентации B и D вращением молекулы вокруг оси С3-С17 на 180°.
Модель Джонса учитывает, что замена водорода на гидроксильную группу в любой ориентации происходит с сохранением конфигурации. Гидроксилирование стероидов в 11а-положение в этой модели рассматривается как трансформация в ориентации A [16, 18]. На рис. 1 видно, что в альтернативной ориентации С наиболее вероятно гидроксилирование в 7а-положение, что было подтверждено экспериментально на 5а-Н-андро-станах. При трансформации 1бр-гидрокси-3-ке-тоандростана (в ориентации А) и его 3р-гидрок-сианалога (в ориентации С) соответствующие
11а- и 7а-гидроксипроизводные были получены с выходом 98 и 90% с помощью культуры Rhizopus nigricans [19] (рис. 2). С этой гипотезой согласуются также результаты ряда работ по гидроксилиро-ванию микроскопическими грибами Д4-3-кето-стероидов [4—6, 8, 9, 18].
Цель работы — трансформация с помощью штамма Curvularia lunata ВКПМ F-981 стероидов Д4-3-кето- и Д5-3ß-гидроксирядов с различными заместителями в кольце D и интерпретация экспериментальных данных с точки зрения триангу-лярной модели субстрат-ферментного взаимодействия, разработанной для 5а-Н-стероидов.
Рис. 1. Ориентации стероидной молекулы. I — нормальная, II — альтернативная, III — нормальная перевернутая, IV — альтернативная перевернутая.
МЕТОДИКА
Стероиды. Субстратами для микробиологической трансформации служили: эстр-4-ен-17р-ол-3-он (нортестостерон — 1), аидрост-4-ен-17р-ол-3-он (тестостерон — 2), андрост-4-ен-3,17-дион (андро-стендион — 3), андроста-1,4-диен-3,17-дион (анд-ростадиендион — 4), андрост-4-ен-9а-ол-3,17-дион (9а-гидроксиандростендион — 5), 17а-метил-анд-рост-4-ен-17р-ол-3-он (17а-метилтестостерон — 6), аидроста-4,6-диен-17р-ол-3-он-17а-кислоты про-пионовой у-лактон (спиродиен — 7), прегн-4-ен-3,20-дион (прогестерон — 8), прегн-4-ен-17а-ол-3,20-дион (17а-гидроксипрогестерон — 9), 16а,17а-оксидо-прегн-4-ен-3,20-дион (оксидо-прогестерон — 10), прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион (кортексолон — 11), 6а-метил-прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион (6а-метилкортексолон — 12), 16а-метил-прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион (16а-метилкортексолон — 13), 20а-метил-прегна-1,4-диен-21а-ол-3-он (14) и 3р-гидроксианалоги 2, 3, 6, 8, 10, 11 — андрост-5-ен-3р,17р-диол (анд-ростендиол — 2а), андрост-5-ен-3р-ол-17-он (андростенолон — 3а), 17а-метил-андрост-5-ен-17р-ол-3-он (6а), прегн-5-ен-3р-ол-20-он (прег-ненолон — 8а), 16а,17а-оксидо-прегн-5-ен-3р-ол-20-он (оксидопрегненолон — 10а), прегн-5-ен-3р,17а,21-триол-20-он (вещество "Я" — 11а) (рис. 2 и 3).
Микроорганизм и его культивирование. Культуру СыгуиШпа ¡ыпШа ВКПМ Б-981 хранили на скошенной агаровой среде, содержащей (г/л): дрожжевой экстракт — 4.0, солодовый экстракт — 10.0, глюкозу — 10.0, агар — 25.0, рН 6.2—6.8. Выращивание гриба и трансформацию соединений проводили на качалке при скорости перемешивания 220 об/мин и температуре 29 ± 1°С. Мицелий, предназначенный для трансформации, выращивали в 2 стадии. Споры гриба в возрасте 14—20 сут смывали со скошенного агара и переносили в 100 мл жидкой среды в конических колбах объемом 750 мл, содержащей (г/л): пептон — 5.0, дрожжевой экстракт — 5.0, соевая мука — 10.0, глюкоза - 20.0, КН2РО4 - 2.0, рН 5.4-5.6. Через
3 сут полученную биомассу в количестве 10 об. % переносили в среду, содержащую (г/л): сахароза — 30.0, дрожжевой экстракт — 5.0, NaNO3 — 2.0, NH4H2PO4 - 3.0, K2HPO4 - 1.0, KCl - 0.5, MgSO4 -0.5, рост в которой продолжался 20-24 ч. Мицелий отделяли от среды, промывали 0.7 М фосфатным буфером и использовали для трансформации.
Трансформация. Трансформация стероидов осуществлялась в 70 мл 0.7 М фосфатного буфера (рН 6.0-6.3), содержащего стероид, который вносили в буфер в зависимости от гидрофобности в количестве 1-15 г/л в виде мелкодисперсного порошка либо в виде водорастворимого комплекса с метил- или гидроксипропил^-циклодекстрином. Отмытую от питательной среды биомассу вносили в буфер в количестве 10 г/л (сухой массы).
Через определенные интервалы времени инкубации отбирали пробы реакционной смеси. При наличии в пробах остаточного субстрата инкубацию продлевали до 48 ч. Стероиды извлекали этилацетатом, качественную оценку содержания продуктов трансформации в пробах проводили методом ТСХ. В конце трансформации мицелий отделяли от реакционной жидкости и экстрагировали отдельно биомассу и жидкую фазу. В случае присутствия стероидов в мицелии экстракты объединяли. Выделение основных гидроксисте-роидов осуществляли аналогично [14]. Побочные продукты трансформации, образовавшиеся в количестве менее 5%, не выделяли.
Для оценки количественного содержания стероидов в экстракте использовали методы препаративной ТСХ, ВЭЖХ и Н1ПМР. Для ТСХ использовали стеклянные пластинки фирмы "Merck" (Германия). Структура полученных соединений установлена с помощью Н1ПМР-спектроскопии и сравнением с известными образцами. Данные представлены в табл. 1 и 2.
Приборы. Спектры ПМР снимали на спектрометре AC200-31 ("Bruker", Германия), масс-спектры - на масс-спектрометре MS-30 ("Kratos", Великобритания).
Таблица 1. ПМР -спектры продуктов гидроксилирования Д4-3-кетостероидов (СОС13, 5)
Стероиды 18-Н 19-Н 4-Н снон Другие сигналы
14а-гидрокси-3* 0.91 с 1.15с 5.63 с 4.30 с (14а-ОН)
14а-гидрокси-4 1.06 с 1.25 с 6.077 т 6.23 кд 1 = 12 Гц 1 = 1.8 Гц (2-Н) 7.033 д I = 10 Гц (1-Н)
9а, 14а-дигидрокси-3* 1.05 с 1.37 с 5.85 д 3.12 с (9а-ОН) 4.08 с (14а-ОН)
11Р,14а-дигидрокси-3* 0.91 с 1.144с 5.72д ]= 1.4 Гц 4.69 с (14а-ОН) 5.59 с (11Р-ОН) 4.24 с (11а-Н)
11Р-гидрокси-1 0.82 с - 5.78 с - 3.62 м (17-Н), 4.27 м (11а-Н)
11Р-гидрокси-2 1.01 с 1.43 с 5.65 с 3.58 кд 1 = 8.8 Гц 1 = 7.5 Гц (17а-Н) 4.36 м и = 9.4 Гц (11а-Н)
1 ф-гидрокси-б 0.89 с 1.13с 5.65 с 1.238 с (17-Н), 4.09 кд (11а-Н)
7а-гидрокси-6 0.89 с 1.225 с 5.79 с 1.196 с (17-СН3) 3.95 кд (7Р-Н)
7р-гидрокси-6 0.91 с 1.22 с 5.71 с 1.312 с (17-СН3) 4.04 кд (7а-Н)
11Р,17а-дигидрокси-8 1.01 с 1.41 с 5.66 с 2.72 уш. с (17-ОН) 2.27 с (21-Н), 4.45 м 1= 3.1 Гц(11а-Н)
11Р-гидрокси-8 0.99 с 1.43 с 5.66 с 2.1 с (21-Н) 3.16 м и =12 Гц (17-Н) 4.27 кд 1=3 Гц (11а-Н)
7а-гидрокси-8 0.73 с 1.19с 5.79 с 2.1 с (21-Н) 3.16 м (17-Н) 4.39 м (7Р-Н)
11Р-гидрокси-7* 1.25 с 1.35 с 6.05 с 4.55с (11Р-ОН) 3.43 кд (7Р-Н), 3,6 д (ба-Н) ]6 7= 3.54 Гц 4.4 кд £1 = 9.1 Гц (11а-Н)
1 ф-гидрокси-Ю 1.32 с 1.43 с 5.65д 1= 1.5 Гц 2.05 с (21-Н), 3.77 с (16-Н) 4.40 кд и = 8.2 Гц (11а-Н)
11Р-гидрокси-14 0.86 с 1.35 с 5.8 с 4.15 кд (11а-Н), 6.03 д(2-Н), 7.24д(1-Н)
7р-гидрокси-14 1.02 с 1.24 с 6.1 д 4.2т 1 = 15.5 Гц (7-Н), 6.2д (2-Н), 7.05м (1-Н)
14а -гидрокси-11* 0.71 с 1.02 с 5.81 с 4.01м (14а-ОН) 4.35 м (21-Н)
14а-гидрокси-13 0.75 с 1.15с 5.73 с 1.18 с (3-Н), 4.45 м (21-Н)
00
►и 0
8
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.