научная статья по теме ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ СТЕРОИДНОЙ МОЛЕКУЛЫ НА НАПРАВЛЕНИЕ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ГРИБОМ CURVULARIA LUNATA Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ СТЕРОИДНОЙ МОЛЕКУЛЫ НА НАПРАВЛЕНИЕ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ГРИБОМ CURVULARIA LUNATA»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 4, с. 382-390

УДК 547.92

ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ СТЕРОИДНОЙ МОЛЕКУЛЫ НА НАПРАВЛЕНИЕ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ГРИБОМ Curvularia lunata

© 2013 г. В. А. Андрюшина, В. В. Ядерец, Т. С. Стыценко, А. В. Дружинина, Н. Е. Войшвилло

Центр "Биоинженерия"РАН, Москва, 117312 e-mail: andryushina@rambler.ru Поступила в редакцию 08.11.2012 г.

Идентифицированы с помощью Н1ПМР -спектроскопии, а также сравнением со стандартными образцами, основные и побочные продукты гидроксилирования мицелием C. lunata ВКПМ F-981 четырнадцати Д4-3-кетостероидов рядов эстрана, андростана и прегнана и шести их Д5-3Р-гидрокси-аналогов. Полученные экспериментальные данные рассмотрены с точки зрения триангулярной модели субстрат-ферментного взаимодействия.

Выявлена зависимость направления гидроксилирования стероидной молекулы и ориентации гид-роксигрупп от структуры исходного субстрата.

Б01: 10.7868/8055510991304003Х

За период, прошедший после сообщения [1] в 1952 г. Петерсоном и Мюрреем о наличии у плесневого гриба ЕН^орыз arrhizus способности осуществлять 11а-гидроксилирование стероидов, была осуществлена микробная трансформация соединений ряда эстрана, андростана и прегнана. Было установлено, что микроскопические грибы всех классов могут вводить гидроксигруппы почти во все положения стероидной молекулы, причем более 300 штаммов проявляют способность к 7а- и 11а-гидроксилированию. Около 100 видов образуют смесь 11а- и 11р-гидроксисоединений, однако только единицы способны селективно вводить гидроксигруппы в 8р- и 11р-положения, доступ к которым, возможно, затруднен 18Р- и 19Р-метильными группами [2—8].

Вводить в стероиды 11р-гидроксигруппу способны штаммы рода Сигуи1аИа, в частности вид С. 1ипа1а, с помощью которого получен большой набор 11р-гидроксистероидов ряда андростана, прегнана и эстрана [3—6, 9—15]. Особенность гриба С. 1ипа1а заключается в осуществлении, главным образом, аксиального гидроксилирования. В зависимости от структуры Д4-3-кетостероидов С. 1ипа1а преимущественно вводит гидроксигруппы в 11Р- или 14а-, а также в 9а-положения молекулы. Побочные гидроксисоединения могут появляться вследствие 6Р- и 7а-гидроксилирования, а также восстановления 17- и 20-кетогрупп [2—6].

Несмотря на большое количество данных по трансформации различных стероидов микроорганизмами, зависимость между строением стероидной молекулы и направлением ее гидроксилирования еще недостаточно изучена. Группой ученых

Оксфордского университета под руководством проф. Джонса на примере 5а-андростанов была разработана триангулярная модель субстрат-ферментного взаимодействия [16], основанная на предположении о том, что гидроксилирование стероидного субстрата в различные положения осуществляется одним и тем же ферментом [17].

Согласно этой модели, кислородные группы стероида при С3 и С17 (или С20) выполняют функцию связывания стероидного субстрата с ферментом, а направление вводимой в молекулу гидроксигруппы зависит от ориентации стероида по отношению к ферменту. Рассматриваются 4 теоретически возможные ориентации: A — нормальная (normal), B — нормальная перевернутая (normal inverted), C — альтернативная (reverse), D — альтернативная перевернутая (reverse inverted) (рис. 1). Ориентации А и С могут быть получены друг из друга вращением молекулы вокруг оси, перпендикулярной плоскости ее колец, а ориентации B и D вращением молекулы вокруг оси С3-С17 на 180°.

Модель Джонса учитывает, что замена водорода на гидроксильную группу в любой ориентации происходит с сохранением конфигурации. Гидроксилирование стероидов в 11а-положение в этой модели рассматривается как трансформация в ориентации A [16, 18]. На рис. 1 видно, что в альтернативной ориентации С наиболее вероятно гидроксилирование в 7а-положение, что было подтверждено экспериментально на 5а-Н-андро-станах. При трансформации 1бр-гидрокси-3-ке-тоандростана (в ориентации А) и его 3р-гидрок-сианалога (в ориентации С) соответствующие

11а- и 7а-гидроксипроизводные были получены с выходом 98 и 90% с помощью культуры Rhizopus nigricans [19] (рис. 2). С этой гипотезой согласуются также результаты ряда работ по гидроксилиро-ванию микроскопическими грибами Д4-3-кето-стероидов [4—6, 8, 9, 18].

Цель работы — трансформация с помощью штамма Curvularia lunata ВКПМ F-981 стероидов Д4-3-кето- и Д5-3ß-гидроксирядов с различными заместителями в кольце D и интерпретация экспериментальных данных с точки зрения триангу-лярной модели субстрат-ферментного взаимодействия, разработанной для 5а-Н-стероидов.

Рис. 1. Ориентации стероидной молекулы. I — нормальная, II — альтернативная, III — нормальная перевернутая, IV — альтернативная перевернутая.

МЕТОДИКА

Стероиды. Субстратами для микробиологической трансформации служили: эстр-4-ен-17р-ол-3-он (нортестостерон — 1), аидрост-4-ен-17р-ол-3-он (тестостерон — 2), андрост-4-ен-3,17-дион (андро-стендион — 3), андроста-1,4-диен-3,17-дион (анд-ростадиендион — 4), андрост-4-ен-9а-ол-3,17-дион (9а-гидроксиандростендион — 5), 17а-метил-анд-рост-4-ен-17р-ол-3-он (17а-метилтестостерон — 6), аидроста-4,6-диен-17р-ол-3-он-17а-кислоты про-пионовой у-лактон (спиродиен — 7), прегн-4-ен-3,20-дион (прогестерон — 8), прегн-4-ен-17а-ол-3,20-дион (17а-гидроксипрогестерон — 9), 16а,17а-оксидо-прегн-4-ен-3,20-дион (оксидо-прогестерон — 10), прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион (кортексолон — 11), 6а-метил-прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион (6а-метилкортексолон — 12), 16а-метил-прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион (16а-метилкортексолон — 13), 20а-метил-прегна-1,4-диен-21а-ол-3-он (14) и 3р-гидроксианалоги 2, 3, 6, 8, 10, 11 — андрост-5-ен-3р,17р-диол (анд-ростендиол — 2а), андрост-5-ен-3р-ол-17-он (андростенолон — 3а), 17а-метил-андрост-5-ен-17р-ол-3-он (6а), прегн-5-ен-3р-ол-20-он (прег-ненолон — 8а), 16а,17а-оксидо-прегн-5-ен-3р-ол-20-он (оксидопрегненолон — 10а), прегн-5-ен-3р,17а,21-триол-20-он (вещество "Я" — 11а) (рис. 2 и 3).

Микроорганизм и его культивирование. Культуру СыгуиШпа ¡ыпШа ВКПМ Б-981 хранили на скошенной агаровой среде, содержащей (г/л): дрожжевой экстракт — 4.0, солодовый экстракт — 10.0, глюкозу — 10.0, агар — 25.0, рН 6.2—6.8. Выращивание гриба и трансформацию соединений проводили на качалке при скорости перемешивания 220 об/мин и температуре 29 ± 1°С. Мицелий, предназначенный для трансформации, выращивали в 2 стадии. Споры гриба в возрасте 14—20 сут смывали со скошенного агара и переносили в 100 мл жидкой среды в конических колбах объемом 750 мл, содержащей (г/л): пептон — 5.0, дрожжевой экстракт — 5.0, соевая мука — 10.0, глюкоза - 20.0, КН2РО4 - 2.0, рН 5.4-5.6. Через

3 сут полученную биомассу в количестве 10 об. % переносили в среду, содержащую (г/л): сахароза — 30.0, дрожжевой экстракт — 5.0, NaNO3 — 2.0, NH4H2PO4 - 3.0, K2HPO4 - 1.0, KCl - 0.5, MgSO4 -0.5, рост в которой продолжался 20-24 ч. Мицелий отделяли от среды, промывали 0.7 М фосфатным буфером и использовали для трансформации.

Трансформация. Трансформация стероидов осуществлялась в 70 мл 0.7 М фосфатного буфера (рН 6.0-6.3), содержащего стероид, который вносили в буфер в зависимости от гидрофобности в количестве 1-15 г/л в виде мелкодисперсного порошка либо в виде водорастворимого комплекса с метил- или гидроксипропил^-циклодекстрином. Отмытую от питательной среды биомассу вносили в буфер в количестве 10 г/л (сухой массы).

Через определенные интервалы времени инкубации отбирали пробы реакционной смеси. При наличии в пробах остаточного субстрата инкубацию продлевали до 48 ч. Стероиды извлекали этилацетатом, качественную оценку содержания продуктов трансформации в пробах проводили методом ТСХ. В конце трансформации мицелий отделяли от реакционной жидкости и экстрагировали отдельно биомассу и жидкую фазу. В случае присутствия стероидов в мицелии экстракты объединяли. Выделение основных гидроксисте-роидов осуществляли аналогично [14]. Побочные продукты трансформации, образовавшиеся в количестве менее 5%, не выделяли.

Для оценки количественного содержания стероидов в экстракте использовали методы препаративной ТСХ, ВЭЖХ и Н1ПМР. Для ТСХ использовали стеклянные пластинки фирмы "Merck" (Германия). Структура полученных соединений установлена с помощью Н1ПМР-спектроскопии и сравнением с известными образцами. Данные представлены в табл. 1 и 2.

Приборы. Спектры ПМР снимали на спектрометре AC200-31 ("Bruker", Германия), масс-спектры - на масс-спектрометре MS-30 ("Kratos", Великобритания).

Таблица 1. ПМР -спектры продуктов гидроксилирования Д4-3-кетостероидов (СОС13, 5)

Стероиды 18-Н 19-Н 4-Н снон Другие сигналы

14а-гидрокси-3* 0.91 с 1.15с 5.63 с 4.30 с (14а-ОН)

14а-гидрокси-4 1.06 с 1.25 с 6.077 т 6.23 кд 1 = 12 Гц 1 = 1.8 Гц (2-Н) 7.033 д I = 10 Гц (1-Н)

9а, 14а-дигидрокси-3* 1.05 с 1.37 с 5.85 д 3.12 с (9а-ОН) 4.08 с (14а-ОН)

11Р,14а-дигидрокси-3* 0.91 с 1.144с 5.72д ]= 1.4 Гц 4.69 с (14а-ОН) 5.59 с (11Р-ОН) 4.24 с (11а-Н)

11Р-гидрокси-1 0.82 с - 5.78 с - 3.62 м (17-Н), 4.27 м (11а-Н)

11Р-гидрокси-2 1.01 с 1.43 с 5.65 с 3.58 кд 1 = 8.8 Гц 1 = 7.5 Гц (17а-Н) 4.36 м и = 9.4 Гц (11а-Н)

1 ф-гидрокси-б 0.89 с 1.13с 5.65 с 1.238 с (17-Н), 4.09 кд (11а-Н)

7а-гидрокси-6 0.89 с 1.225 с 5.79 с 1.196 с (17-СН3) 3.95 кд (7Р-Н)

7р-гидрокси-6 0.91 с 1.22 с 5.71 с 1.312 с (17-СН3) 4.04 кд (7а-Н)

11Р,17а-дигидрокси-8 1.01 с 1.41 с 5.66 с 2.72 уш. с (17-ОН) 2.27 с (21-Н), 4.45 м 1= 3.1 Гц(11а-Н)

11Р-гидрокси-8 0.99 с 1.43 с 5.66 с 2.1 с (21-Н) 3.16 м и =12 Гц (17-Н) 4.27 кд 1=3 Гц (11а-Н)

7а-гидрокси-8 0.73 с 1.19с 5.79 с 2.1 с (21-Н) 3.16 м (17-Н) 4.39 м (7Р-Н)

11Р-гидрокси-7* 1.25 с 1.35 с 6.05 с 4.55с (11Р-ОН) 3.43 кд (7Р-Н), 3,6 д (ба-Н) ]6 7= 3.54 Гц 4.4 кд £1 = 9.1 Гц (11а-Н)

1 ф-гидрокси-Ю 1.32 с 1.43 с 5.65д 1= 1.5 Гц 2.05 с (21-Н), 3.77 с (16-Н) 4.40 кд и = 8.2 Гц (11а-Н)

11Р-гидрокси-14 0.86 с 1.35 с 5.8 с 4.15 кд (11а-Н), 6.03 д(2-Н), 7.24д(1-Н)

7р-гидрокси-14 1.02 с 1.24 с 6.1 д 4.2т 1 = 15.5 Гц (7-Н), 6.2д (2-Н), 7.05м (1-Н)

14а -гидрокси-11* 0.71 с 1.02 с 5.81 с 4.01м (14а-ОН) 4.35 м (21-Н)

14а-гидрокси-13 0.75 с 1.15с 5.73 с 1.18 с (3-Н), 4.45 м (21-Н)

00

►и 0

8

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком