ВОПРОСЫ ИХТИОЛОГИИ, 2007, том 47, № 5, с. 700-706
УДК 597.554.3.154.31
ВЛИЯНИЕ СВЕРХМАЛЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ N-METM-N'-HHTPO-N-НИТРОЗОГУАНИДИНА НА РАННИЙ ОНТОГЕНЕЗ ПЛОТВЫ RUTILUS RUTILUS: ХАРАКТЕРИСТИКА МИТОЗОВ В КЛЕТКАХ ЗАРОДЫШЕЙ, ДИНАМИКА ВЫЛУПЛЕНИЯ И
МОРФОЛОГИЯ ЛИЧИНОК
© 2007 г. Ю. Г. Изшмов*, М. Г. Таликина
Институт биологии внутренних вод РАН - ИБВВ, Борок Ярославской области
* E-mail: izum@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 07.11.2006 г.
Икру плотвы Rutilus rutilus инкубировали первые 48 ч в растворе ^метил-№-нитро-^нитрозогуа-нидина (MNNG) с концентрацией от 3 х 10-7 до 3 х 10-1 мг/л. Воздействие привело к изменению ми-тотического индекса бластомеров и увеличению частоты аберрантных митозов. Зависимости изученных показателей от концентрации нелинейны. Вылупление зародышей ускорялось или замедлялось при разных концентрациях агента. Инкубация икры в испытанном диапазоне концентраций MNNGN приводит к снижению размерно-массовых показателей личинок.
В обширной литературе по действию сверхмалых концентраций биологически активных соединений выделяются несколько особенностей их действия на позвоночных животных. Суть их в том, что эффекты сверхмалых концентраций биологически активных веществ в пределах 1 х 10-5-1 х 10-20 М совпадают по силе действия с концентрациями, превосходящими их на многие порядки, имеет место "мертвая зона", в которой эффект отсутствует, а также наблюдается неустойчивость величины и знака эффекта при неизменных условиях эксперимента (Бурлакова и др., 1990; Бурлакова, 1999; Гуревич, 2001).
Наше первое обращение к проблеме действия низких концентраций, выполненное на плотве Rutilus гшИш - традиционном для нас объекте исследований морфогенетической изменчивости в экспериментальных и природных условиях, выявило сходную парадоксальную закономерность. При остром воздействии растворами хлорофоса в диапазоне 1 х 10-1-1 х 10-6 мг/л на осемененную икру зависимость показателей активности ферментов пищеварения и параметров линейно-весового роста от концентрации раствора была и-образной. Отрицательное влияние на выживаемость, гаме-тогенез и гистофизиологию паренхимы печени сеголеток показали наиболее низкие концентрации (Таликина и др., 2005; Голованова, Таликина, 2006).
Кроме того, нелинейный характер дозовой зависимости проявился при анализе изменчивости структуры осевого скелета у сеголеток и частоты аномалий в его отделах. Таким образом, получены достаточно убедительные данные о том, что
сверхмалые количества испытанного токсического вещества являются не только действующими, но и обнаруживают разнонаправленное воздействие на фенотипические и морфофункциональ-ные характеристики плотвы. Это обстоятельство привлекло наше внимание, и мы решили провести эксперимент с применением широкого диапазона концентраций химического мутагена с хорошо известным механизмом действия на наследственные структуры. Им послужил мутаген ^метил-№-нитро-^нитрозогуанидин (MNNG), широко используемый в работах по индуцированию канцерогенеза у рыб (Marty et al., 1990; Kelly et al., 1992; Hendricks et al., 1995; Orner et al., 1996; Spitsbergen et al., 2000).
MNNG - метилирующий агент с прямым влиянием на химическую структуру ДНК, поскольку служит источником введения в ее молекулы радикала CH3 (Bunton, Wolfe, 1996). Помимо этого, его мутагенный эффект связан с трансформацией до 80% димера азотистых оснований - гуанин : цито-зин в аденин : тимин, что, как полагают исследователи, не может не отражаться на генетических свойствах хромосом (Amanuma et al., 2004).
Цель данной работы состояла в определении эффективности прямого влияния сверхнизких количеств MNNG, соответствующих 1 х 10-10-1 х х10-12 M, на цитогенетические характеристики зародышевых клеток и некоторые показатели развития эмбрионов и личинок плотвы.
При постановке эксперимента мы исходили из предположения, что использованная нами экспериментальная модель позволит выявить некоторые типологические особенности адаптивных ре-
Таблица 1. Митотическая активность и аберрантные митозы (М± т) зародышевых клеток плотвы КиШия тиШи при воздействии MNNG
Показатели Кон- Концентрация MNNG, мг/л
троль 3 х 10-7 3 х 10-6 3 х 10-5 3 х 10-4 3 х 10-3 3 х 10-2 3 х 10-1
Всего бластомеров, шт. 8240 7880 7565 8260 9400 6300 7850 7250
Всего делящихся 560 789 523 391 436 403 458 467
бластомеров, шт.
Число делящихся бласто-
меров в %о, в том числе:
- метафаз в норме 36.1 ± 3.5 33.3 ± 2.5 21.1 ± 1.3* 14.2 ± 0.1* 15.8 ± 1.6* 24.3 ± 4.2 26.3 ± 3.0 30.5 ± 2.8
- метафаз аберрантных 1.9 ± 0.5 13.4 ± 0.1* 14.2 ± 2.8 7.5 ± 0.1* 5.3 ± 1.3* 7.1 ± 1.3* 4.1 ± 1.5 3.3 ± 0.6
- анафаз и телофаз 25.1 ± 3.1 32.7 ± 2.9 18.5 ± 1.0 16.8 ± 0.1* 13.8 ± 2.6* 20.8 ± 1.2 24.0 ± 2.6 26.3 ± 3.5
в норме
- анафаз и телофаз 2.7 ± 0.6 16.9 ± 1.7* 16.4 ± 1.3* 9.1 ± 0.1* 11.1 ± 4.1* 9.0 ± 1.1* 7.3 ± 2.1* 5.1 ± 0.7
аберрантных
Митотический индекс, % 65.9 ± 5.5 96.4 ± 6.9* 70.5 ± 4.3 47.6 ± 0.4* 46.7 ± 4.3 61.1 ± 5.9 61.7 ± 5.2 65.3 ± 4.4
Число аберрантных мито-
зов, в % от митотического
индекса:
- метафаз 2.9 ± 0.8 14.1 ± 1.2* 20.3 ± 2.6* 15.7 ± 0.1* 11.1 ± 1.7* 11.6 ± 1.8* 6.9 ± 2.6 5.2 ± 1.3
- анафаз и телофаз 4.2 ± 1.2 17.5 ± 0.6* 23.2 ± 0.4* 19.2 ± 0.1* 22.8 ± 6.1* 14.8 ± 1.6* 11.4 ± 2.8* 7.9 ± 1.4
- всего 7.1 ± 0.7 31.5 ± 0.6* 43.5 ± 2.9* 34.9 ± 0.1* 33.9 ± 7.8* 26.4 ± 3.3* 18.4 ± 3.6* 13.2 ± 2.6*
Примечание. * - здесь и в табл. 3 различия от контроля достоверны при р = 0.95.
акций развивающегося организма, обусловленные непосредственным влиянием на его наследственные структуры, что немаловажно для понимания механизма антропогенно индуцированных микроэволюционных преобразований у рыб (Изюмов и др., 1998).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Для опытов использовали осемененную икру плотвы, полученную от выловленных на нерестилище Рыбинского водохранилища 4 мая 2006 г. 5 самок и 6 самцов.
Через 7-10 мин после осеменения икру (около 3000 шт. для каждого из вариантов) поместили в кристаллизаторы, после набухания и приклеивания залили равными объемами растворов речной воды, содержащих 3 х 10-7, 3 х 10-6, 3 х 10-5, 3 х 10-4, 3 х 10-3, 3 х 10-2 и 3 х 10-1 мг/л MNNG. Контролем служила икра, инкубировавшаяся в таких же кристаллизаторах с речной водой. Экспозиция зародышей в токсических средах при температуре инкубации 14.5-16.0°С составляла 48 ч. Приготовление растворов и их смену, а также смену воды в контроле проводили дважды в сутки. После рассасывания желточного мешка и перехода на внешнее питание личинок зафиксированы в 4%-ном растворе формалина для анализа размерно-весовых показателей. В каждой опытной группе измерили длину 100 личинок; для вычис-
ления сырой массы тела одной личинки использовали результаты трех взвешиваний по 100120 личинок в каждом. Сухую массу определили путем высушивания проб при 105°С.
В период инкубации икры, от оплодотворения до вылупления, число развивающихся зародышей подсчитывали каждые 12 ч, после вылупления их жизнеспособность оценивали каждые сутки.
Для определения числа аберрантных эмбриональных митозов зародыши в возрасте 24 ч (стадия поздней бластулы) фиксировали в смеси этанола и ледяной уксусной кислоты (3 : 1). Цитоге-нетический анализ проводили на тотальных препаратах раздавленных зародышей, окрашенных ацетоорсеином (Методы биологии развития, 1974). Подсчитывали общее число зародышевых клеток на препарате, число метафаз, анафаз и те-лофаз без нарушений, а также число метафаз, анафаз и телофаз с видимыми хромосомными нарушениями. К последним относили хромосомные и хроматидные мосты и полумосты, отставания хромосом при расхождении к полюсам, наличие их отдельных фрагментов в цитоплазме, описанные для ряда лососевых и карповых видов рыб (Прокофьева-Бельговская, 1961; Катасонов, Гомельский, 1991; Таликина и др., 2001). Показателем митотической активности служило общее число делящихся бластоцитов в %%. В каждом из опытных вариантов использовано по 10-12 эм-
95 м 85 § 75
н и
65
кий55
Р 45
и 35
0 25
1 15 S 5
—I——I——I——I——I——I——I—— 0 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 Концентрация MNNG, 3 • 10-я мг/л
45 40 35 30 25 20 15 10 5
^ S « м ые зд он ти
мо мг ео
3 *
н Й
I я
ат
vo й
<
Рис. 1. Митотический индекс (1) и частота встречаемости аномальных митозов (2) зародышевых клеток плотвы Rutilus гихИт.
брионов. Статистическую обработку данных проводили программными пакетами Excel и Statistica for Windows 5.5.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Цитогенетический анализ. Данные о специфике влияния MNNG в ряду испытанных концентраций на величину митотического индекса и частоту хромосомных аномалий митозов в клетках зародышей в возрасте 24 ч приведены в табл. 1 и на рис. 1.
Как видно из рис. 1, кривая зависимости мито-тического индекса от концентрации имеет нелинейный характер. Наиболее очевидное стимулирующее и ингибирующее мутагенное воздействие тестируемого агента отмечено в сравнительно узком диапазоне концентраций -3 х 10-7-3 х 10-5 мг/л, в крайних точках которого выявлено наибольшее и наименьшее число делящихся бластомеров. В правой же части графика, с концентрациями MNNG 3 х 10-3-3 х 10-1 мг/л, средние значения показателя пролиферативной активности зародышей близки к контрольным и имеют тенденцию к росту в зависимости от концентрации. Частоты встречаемости аберрантных митозов в этой части графика, напротив, имеют тенденцию к снижению. Повышенная, по сравнению со спонтанным уровнем, частота встречаемости аберрантных митозов делящихся бластомеров статистически значима на всем пространстве дозового ряда, за исключением крайней правой ее точки - 3 х 10-1 мг/л. Ряд состояний видимых цитогенетических отклонений митозов зародышевых клеток приведен на рис. 2.
Одной из характерных особенностей рассматриваемого дозозависимого ответа является заметное провоцирование нарушений митотического процесса сверхмалыми количествами мутагена. Установлено, что по мере возрастания концентрации (рис. 1) его негативное влияние не-
уклонно снижается, а контрольный уровень хромосомных аберраций достигается в варианте с самой в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.