ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 195-208
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.132:581134.2:5811343:582.261:593.61
ВЛИЯНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ НА МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕРОДА ПРИ ФОТОСИНТЕЗЕ У СИМБИОТИЧЕСКИХ ДИНОФЛАГЕЛЛЯТ
© 2007 г. К. Я. Биль*' ****, Р. Д. Гейтс**, Л. Мускатине**' ***
* Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, Пущино, Московская обл.
** Отдел биологии, экологии и эволюции организмов Калифорнийского университета, Лос-Анджелес, США
*** Лаборатория виноделия, Сода каньон, долина Напа, США **** Международный центр биосферных систем, Тюсон, США и Центр исследований питания и развития,
Сонора, Мексика Поступила в редакцию 01.12.2004 г.
Изучали влияние искусственного "фактора хозяина" (SHF, от synthetic host factor), содержащего свободные аминокислоты, и "фактора хозяина" книдарий (CHF, от crude cnidarian's host factor) на метаболизм углерода при фотосинтезе и начальную стадию синтеза липидов у симбиотических динофла-геллят Symbiodium purchrorum, выделенных из морских анемонов Aiptasia pulchella и рифостроящих кораллов Pocillopora damicornis, и зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardii. Как в кратковременных, так и в длительных экспериментах с использованием меченого углерода у динофлагеллят, инкубированных в присутствии "фактора хозяина" (HF), наблюдали большую скорость накопления 14С на свету, чем у динофлагеллят, помещенных в искусственную морскую воду без HF (контроль). После 15-секундного освещения 14С-глицерин был обнаружен как в динофлагеллятах, инкубированных в морской воде, так и при их инкубации с HF. У динофлагеллят, изолированных из P. damicornis и инкубированных с CHF или SHF, а также у динофлагеллят, изолированных из A. pulchella и инкубированных с CHF, больше 14С накапливалось в глицерине, в то время как у организмов, инкубированных в морской воде, радиоактивная метка попадала преимущественно в этанол-растворимую липидную фракцию. Сходные результаты были получены при инкубировании динофлагеллят, изолированных из P. damicornis, с аспартатом или глютаматом, однако при использовании таурина, серина, валина, глицина и лизина никакого эффекта не наблюдали. Клетки C. reinhardii, инкубированные в бессолевом растворе CHF по сравнению с контролем содержали больше 14С в глицерине и меньше - в этанол-растворимых липидах. Количество С в нейтральных и полярных липидах было одинаковым в динофлагеллятах из A. pulchella, инкубированных в морской воде или в присутствии CHF. Даже со временем не было обнаружено существенных различий в составе 14С-содержа-щих нейтральных липидов, синтезированных в динофлагеллятах, инкубированных в морской воде или воде с CHF. Предполагается, что присутствие HF создает оптимальные условия для достижения максимальной эффективности метаболизма динофлагеллят. В работе представлена биохимическая модель действия HF, основанная на качественной и количественной оценке путей метаболизма углерода в динофлагеллятах, инкубированных в морской воде и в присутствии HF.
Symbiodium purchrorum - Aiptasia pulchella - Pocillopora damicornis - Chlamydomonas reinhardii - кни-дарии - "фактор хозяина" - симбиоз - фотосинтез - дыхание
ВВЕДЕНИЕ
Термин "фактор хозяина" (HF, от host factor) был впервые использован при описании способ-
Сокращения: TAP - Трис-ацетатно-фосфатный буфер; HF -"фактор хозяина" (от host factor); SHF - искусственный HF (от synthetic host factor); CHF - HF книдарий (от crude cnidarian's host factor); HSM - среда с минимальным содержанием солей для солеустойчивых организмов; ДНФГ - 2,4-динитрофенил-гидразин.
Адрес для корреспонденции: Karl Y. Biel. Biosphere Systems International, 12138 N. Sterling Avenue, Tucson, Arizona, 85755 USA. Fax: 1 (520) 908-08-19; e-mail: karlbiel@isp.com
ности гомогенатов тканей коралла Pocillopora damicornis и моллюска Tridacna crocea вызывать in vitro селективное выделение только что фиксированного углерода свежеизолированными сим-биотическими динофлагеллятами [1]. На сегодняшний день опубликовано значительное количество данных, описывающих HF и его свойства в различных симбиотических системах морских членистоногих [2-6]. Многие свойства HF, включая его химическую природу [5-10], термостабильность [1-3, 5, 9-11], влияние на фиксацию углерода [2, 3, 5, 7, 9, 12, 13] и действие на культивируемые и несимбиотические динофлагелляты
195
3*
[6, 8], варьируют в зависимости от вида организма-хозяина.
Несмотря на широкую вариабельность действия HF книдарий - стрекающих кишечнополостных (CHF, от crude cnidarian's host factor), два эффекта можно считать хорошо установленными. Во-первых, выделение углерода динофлагеллята-ми, инкубированными с CHF, всегда значительно выше, чем при инкубировании в морской воде и, во-вторых, под действием HF углерод избирательно выделяется динофлагеллятами в среду инкубации преимущественно в виде глицерина и в меньшем количестве - в виде глюкозы, органических кислот, аминокислот и липидов [1-3, 5, 7, 9, 11].
Способ, благодаря которому CHF благоприятствует селективному высвобождению углерода из изолированных динофлагеллят, остается неясным, хотя два предположения были выдвинуты. HF может содержать сигнальные молекулы, под действием которых углерод фотосинтеза выводится из метаболизма динофлагеллят и выделяется наружу [9]. Предполагают также, что HF может содержать субстраты, которые динофлагел-ляты способны метаболизировать, и эти продукты метаболизма в последующем выделяются ими в окружающую среду [7].
Идентификация биоактивных компонентов HF показала, что их состав меняется в зависимости от вида хозяина и его географического происхождения. Например, искусственный HF (SHF, от synthetic host factor), содержащий те же свободные аминокислоты, что и гомогенат свежеизвлечен-ных тканей коралла P. damicornis, благоприятствует in vitro селективному выделению фиксированного углерода (в основном в виде глицерина) из симбиотических динофлагеллят [7]. Возможность использования химически чистого, искусственного HF вместо грубых гомогенатов тканей, имеющих сложный биохимический состав, позволяет исследовать действие CHF и определить причину вариабельности и противоречивости его свойств. Было показано, что искусственная смесь, основой которой является набор свободных аминокислот (за исключением микоспорин-подоб-ных аминокислот), вызывает у динофлагеллят, изолированных из P. damicornis и Aiptasia pulchel-la, ответную реакцию, идентичную их ответу на действие CHF [7, 14]. Метаболическая эффективность в присутствии SHF поддерживается благодаря все большей доступности субстрата в результате трансаминирования свободных аминокислот [14].
В данной работе SHF использовали параллельно с гомогенатами тканей для исследования in vitro влияния HF на метаболизм углерода у симбиотических динофлагеллят, изолированных из P. damicornis, и биохимического влияния HF на метаболизм динофлагеллят, изолированных из P. damicornis и
A. pulchella. При этом сравнивали влияние CHF и SHF, содержащего биоактивные компоненты, идентичные CHF. Общие закономерности ответа одноклеточных водорослей на действие природного и искусственного HF оценивали путем исследования действия HF на биохимические процессы у Chlamydomonas reinhardii. Представлен гипотетический механизм воздействия HF на ход метаболизма симбиотических динофлагеллят, вызывающий выделение фотосинтетически фиксированного углерода.
МЕТОДИКА
Сбор и содержание организмов. Морские анемоны Aiptasia pulchella и рифостроящие кораллы Pocillopora damicornis собирали на глубине 1 м в коралловом рифе, примыкающем к Гавайскому институту морской биологии (Coconut Island Oahu, Гавайи). Колонии P. damicornis транспортировали в Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе и помещали в морской аквариум с рециркуляцией, температурой 25°С и солнечным освещением через стеклянный фильтр. Кораллы использовали в течение 5 суток после сбора и обрабатывали, как указано ниже.
A. pulchella помещали в чашки Петри, содержащие морскую воду, собранную у пляжа Red-oldo, Калифорния. Сосуды с анемонами выдерживали в инкубаторе Model 8 ("Precision Scientific", США) при 25°С, 12-часовом фотопериоде и освещенности 40 ммоль квант/(м2 с). Анемоны кормили дважды в неделю рачками Artemia sp. nauplii. На следующий день после кормления сосуды чистили и в них меняли воду.
Приготовление природного и искусственного HF. Природный HF готовили из свежих тканей, которые соскребали с поверхности P. damicornis с помощью твердой зубной щетки с последующим суспендированием в 3 мл искусственной морской воды Tropic Marin©, пропущенной через фильтр с порами 0.22 мкм ("Millipore", США), при 4°С. Макрочастицы и динофлагелляты отделяли от гомогената 15-минутным центрифугированием при 15000 g и температуре 4°С. Липидный слой удаляли с поверхности супернатанта, пропуская его через стеклянную вату. Супернатант, содержавший CHF, замораживали при -20°С аликвотами (по 1 мл) и хранили до использования.
Искусственный HF готовили в соответствии с данными о пуле свободных аминокислот, содержащихся в P. damicornis [7]. Отдельные аминокислоты ("Sigma", США) растворяли в дистиллированной воде так, что 200 мМ маточный раствор содержал аминокислоты в той же пропорции, что и оригинальный образец P. damicornis. рН маточного раствора доводили до 8.3 добавлением 1 N NaOH, содержание соли доводили до 33 %о добавлением
NaCl. После фильтрации через фильтр с порами 0.22 мкм, раствор SHF хранили при 4°С до использования (при замораживании до -20°С возможно выпадение осадка).
Изолирование симбиотических динофлагеллят.
Динофлагелляты выделяли из A. pulchella путем гомогенизации анемонов в искусственной морской воде. Ткани животных удаляли из гомогена-та центрифугированием при 1000 g в течение 5 мин, затем супернатант отбрасывали, а динофлагелляты ресуспендировали в морской воде. Центрифугирование и ресуспендирование повторяли три раза для того, чтобы убедиться, что динофлагелляты свободны от большей части остатков животной ткани. Получившийся в итоге осадок ресуспендировали в концентрации 4 х 106 клеток/мл.
Для выделения симбионтов из P. damicor
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.