МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 3, с. 463-479
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ^^^^^^
АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК 577.354.25
ВЛИЯНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ОРТОСТЕРИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ НА КОНФОРМАЦИОННУЮ ПОДВИЖНОСТЬ P-2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРА. МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ
© 2014 г. Г. В. Новиков1*, В. С. Сивожелезов1, К. В. Шайтан2
Институт биофизики клетки Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290 2Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991
Поступила в редакцию 12.08.2013 г.
Принята к печати 19.11.2013 г.
Методом молекулярной динамики исследовано влияние связывания ортостерических лигандов на конфор-мационную подвижность p-2-адренорецептора. Анализ траекторий молекулярной динамики показал, что в апоансамбле рецептора обнаружена небольшая доля конформеров, структурно схожих с его активными формами. В этих структурах регистрировали отклонение трансмембранной спирали VI на величину порядка 2.5—3 А по сравнению с неактивной конформацией. Показано, что явление лиганднезависимой (конститутивной) активности рецептора связано со структурной подвижностью этого белка. С другой стороны, образование комплекса рецептора с полным агонистом приводило к смещению физико-химического равновесия рецептора в сторону его активного подсостояния. Наконец, связывание обратного агониста преимущественно стабилизировало рецептор в области его неактивных конформаций. Таким образом, связывание обратных агонистов является универсальным способом ингибирования спонтанной активности лигандактивируемых рецепторов in vivo. Полученные результаты указывают на то, что связывание лигандов должно приводить к перераспределению предсуществующих конформационных степеней свободы рецептора, а не является движущей силой структурных изменений в нем. Следовательно, ансамбль биологически значимых конформа-ций рецептора уже предопределен на уровне его пространственной архитектуры и может использоваться клеткой в соответствии с ее физиологическими потребностями.
Ключевые слова: конформационная подвижность, семитрансмембранные рецепторы, структурная биоинформатика, метод главных компонент, молекулярная динамика, активация, конститутивная активность.
INFLUENCE OF THE ORTHOSTERIC LIGANDS BINDING ON THE CONFORMATIONAL DYNAMICS OF THE B-2-ADRENERGIC RECEPTOR BY MEANS OF ESSENTIAL DYNAMICS SAMPLING SIMULATION, by G. V. Novikov1*, V. S. Sivozhelezov, K. V. Shaitan ^Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, PUshchino, Moscow Region, 142290 Russia; 2Department of Biology, Moscow State University, 119991 Russia; *e-mail: gnovikov87@gmail.com). The influence of binding of the orthosteric ligands on the conformational dynamics of the beta-2-adrenoreceptor was identified using the molecular dynamics method. It was found that there was a little fraction of the active states of the receptor in its apo (ligand free) ensemble. Analysis of the MD trajectories indicated that such spontaneous activation of the receptor is accompanied by the motion of its VI helix. Thus receptor's constitutive activity is the direct result of its conformational dynamics. On other hand binding of the full agonist resulted in the significant shift of the initial equilibrium towards its active state. Finally binding of the inverse agonist stabilized receptor in its inactive state. Its likely that the binding of the inverse agonists might be the universal way of the constitutive activity inhibition. Our results indicate that ligand binding rather redistribute pre-existing conformational degrees of freedom (in accordance to the Monod-Wyman-Changeux-Model) than cause induced fit in it. Therefore ensemble of the biological-relevant receptor conformations have been encoded in its spatial structure and individual conformations from that ensemble might be used by the cell according to the physiological behavior.
Keywords: Seven-transmembrane receptors, conformational dynamics, receptor activation, X-ray crystallography, principal components analysis, molecular dynamics, constitutive activity.
DOI: 10.7868/S002689841403015X
Принятые сокращения: МД — молекулярная динамика; EDS — метод основного динамического перебора, Essential Dynamics Sampling; GPCR— рецепторы, сопряженные с G-белком; 7-ТМ — семитрансмембранный; ТМД — трансмембранный домен; PDB — банк данных белковых структур; СКО — среднеквадратичное отклонение; PCA (Principal Componential Analysis) — метод анализа главных компонент; ГК — главная компонента.
* Эл. почта: gnovikov87@gmail.com
ВВЕДЕНИЕ
Семитрансмембранные (7-ТМ) рецепторы играют первостепенную роль в межклеточных коммуникациях, аутокринной и паракринной регуляциях клеточных функций, а также в процессах подвижности и адгезии клеток [1], поэтому исследование этих белков всегда было одним из основных направлений клеточной физиологии, биофизики и фармакологии. Помимо чисто академического интереса, экспериментальный и теоретический анализ 7-ТМ-рецепторов имеет важное прикладное значение. Достаточно сказать, что как минимум половина известных лекарственных препаратов — лиганды этих белков [2, 3]. Долгое время считали, что переход рецептора в активное состояние является прямым следствием его взаимодействия с агонистом. Тем не менее в существующих представлениях об активации этих белков все еще много неясного. Одно из важных функциональных свойств лигандактивируемых рецепторов — существование их лиганднезависимой (конститутивной) активности in vivo [4]. Принимая во внимание огромное число заболеваний, связанных с повышенной конститутивной активностью, клетка должна выступать в роли своеобразного реостата, задача которого сводится к минимизации числа спонтанно активированных рецепторов. С другой стороны, благодаря появлению большого числа экспериментальных структур ро-допсинподобных рецепторов, установлен ряд структурных особенностей, связанных с их активацией. Так показано, что этот процесс сопровождается структурными изменениями на уровне отдельных трансмембранных a-спиралей рецептора [5]. Тем не менее в случае Р-адренергических рецепторов конформация этих белков, закристаллизованных с полными агонистами, чаще соответствовала их неактивной форме. Совокупность этих экспериментальных фактов свидетельствует о том, что связывание полных агонистов — необходимое, но недостаточное условие для активации родоп-синподобных рецепторов. Необходимо ясное понимание того, какие именно конформации рецептора соответствуют его истинно активному состоянию, и каким именно путем в конформационом пространстве движется рецептор для его достижения. Согласно современным представлениям, рецептор представляет собой ансамбль структурно близких подсостояний, непрерывный перебор между которыми обусловлен тепловыми флуктуа-циями [6, 7]. При этом любое внешнее воздействие (например, связывание лигандов, изменение концентрации электролитов, либо же введение мутаций) приводит к перераспределению исходного равновесия, стабилизируя специфические подсостояния [8]. В работах Кенакина пока-
зано, что каждое функциональное подсостояние рецептора является в сущности конформацион-ным субансамблем. Находясь в различных подсо-стояниях, рецептор обладает специфической аффинностью по отношению к различным транс-дьюсерам (рис. 1) [9, 10]. Если следовать этой концепции, актуален поиск методов, позволяющих получить полноценное представление относительно всего спектра возможных подсостояний лиганд-активируемых рецепторов. Один из наиболее перспективных способов реализации этой идеи состоит в проведении вычислительных экспериментов [11—13]. С помощью метода молекулярной динамики (МД) удалось детектировать наиболее короткоживущие (менее стабильные) подсостояния исследуемых белков. Эти конфор-меры, зачастую остающиеся "незамеченными" современными экспериментальными методами, так же могут обладать функциональной значимостью. Например, известно, что активация многих рецепторов эндогенными агонистами нередко приводит к возникновению нежелательных побочных эффектов, связанных с активацией дополнительных сигнальных каскадов. Учитывая подобную "функциональную плюрипотент-ность", задача современного дизайна лекарств сводится к разработке лигандов, стабилизирующих наиболее узкие области предсуществующе-го конформационного пространства рецептора. В настоящей работе на примере Р-2-адреноре-цептора успешно применен метод управляемой МД для объективной оценки эффективности ор-тостерических лигандов. Таким образом, полученные результаты, помимо фундаментальной значимости, применимы так же в области биотехнологии для разработки и дизайна новых лекарственных препаратов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объект исследования. Исследуемый в настоящей работе Р-2-адренорецептор представляет собой идеальную модель для изучения особенностей активации родопсинподобных рецепторов. Именно для этого белка расшифровано более десятка пространственных структур, соответствующих его различным подсостояниям. С другой стороны, лиганды этого белка обладают высоким терапевтическим потенциалом. Традиционно эти низкомолекулярные вещества принято классифицировать в соответствии с их влиянием на базовую активность рецептора-мишени. Показано, что связывание полных и частичных агонистов опосредует максимальный и субмаксимальный биологический отклик рецептора соответственно. С другой стороны, связывание обратных агонистов приводит к уменьшению базовой активности рецептора
Сигнализация по аррестинзависимому пути
Рис. 1. Схема концепции "функциональной избирательности", служащей для описания функциональных аспектов 7-ТМ-рецепторов, на примере Р-2-адренорецептора. В нижней части рисунка показаны различные пути сигнализации, связанные со стабилизацией специфической конформации рецептора.
за счет снижения уровня его конститутивной активности. Наконец, связывание нейтральных антагонистов не оказывает прямого влияния на уровень базовой активности рецептора, стерически блокируя сайт связывания ортостерических ли-гандов. Используя методы высокопропускного скрининга, уже удалось выделить целый ряд высокоэффективных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.