БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.962-966
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.352.4
ВЛИЯНИЕ ТАУРИНА НА СИСТЕМУ ТРАНСПОРТА ИОНОВ
В МИТОХОНДРИЯХ
© 2008 г. С.В. Мурзаева, Н.В. Белоелудцева, Л. Гавровекая*, Г.Д. Миронова
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области,
ул. Институтская, 3;
*ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, 197376, Санкт-Петербург,
ул. Академика Павлова, 12
E-mail: SVmurzaeva@rambler.ru
Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Исследовано влияние таурина на АТФ-зависимое набухание митохондрий, характеризующее активность митохондриального АТФ-чувствительного К -канала и формирование Са -зависимых пор, отличающихся по чувствительности к циклоспорину А в митохондриях печени крыс. Показано, что таурин в микромолярных концентрациях 0,5 - 125 мкМ стимулирует энергозависимое набухание митохондрий. Таурин в физиологических концентрациях 0,5 - 20 мМ не влияет 2н+а АТФ-зависимое набухание и на образование циклоспорин А-нечувствительной пальмитат/Са -активируемой поры в митохондриях. Обнаружено, что такие концентрации таурина увеличивают скорость циклоспорин А-чувствительного набухания митохондрий, индуцированного Са и Pi и уменьшают Са емкость митохондрий. Обсуждаются различия в действии физиологических концентраций таурина на АТФ-зависимый транспорт ионов К , Са в митохондриальных мембранах, по сравнению с клеточными.
Ключевые слова: митг+охондрии, мито-КАТФ, циклоспорин А-чувствительная Са2+-индуцируемая пора, пальмитат/Ca -активируемая пора, циклоспорин А, таурин.
Таурин является природной аминоэтансуль-фоновой кислотой, присутствующей в свободном состоянии в больших количествах в животных тканях, особенно в сердце, скелетных мышцах, центральной нервной системе, в белых клетках крови [1,2]. Таурин вовлекается во многие физиологические процессы, проявляя осмо-регуляторное и антиоксидантное действие. Кроме того, он участвует в регуляции проводимости ионов Са2+, 2п2+, Mg2+, Ка+и К+ через биологические мембраны и оказывает положительное действие на общий обмен веществ, артериальное давление, содержание сахара в крови, нарушение сердечного ритма и т.д. Биотроп-ность таурина при лечении сердечных патологий, а также снижение концентрации этой аминокислоты в кардиомиоцитах во время инфаркта миокарда [3,4] инициировали ряд исследований по влиянию таурина на АТФ-чувстви-тельные калиевые каналы клеточных мембран (цито-КАТФ). Последние, как известно, проявляют кардиопротекторные свойства, защищая сердце от ишемических повреждений [5]. Было
Сокращение: MPT - циклоспорин A-чувствительная Са2+-индуцируемая пора (mitochondrial permeability transition pore).
показано, что таурин дозозависимо блокирует цито-КАТФ в мембранах кардиомиоцитов кролика и свиньи [6,7], ооцитов и Р-клеток поджелудочной железы крыс [8]. Механизм действия таурина связывают с регуляторным взаимодействием с бензамидосвязывающим участком субъединицы SUR1 на рецепторной стороне, чувствительной к сульфонилмочевинам [8,9].
Кардиозащитные свойства таурина как природного регулятора вызывают интерес в плане изучения механизма его действия на митохон-дриальный АТФ-чувствительный К+-канал (ми-то-Катф). Существует представление, что именно активация мито-КАТФ является ключевым механизмом в адаптации животных к гипоксии и защите сердца при ишемических повреждениях миокарда [5,9]. В нашей лаборатории проводятся исследования природных модуляторов мито-КАТФ, которые способствуют защите сердца при ишемических повреждениях и инфаркте миокарда и модуляторов митохондриальных Са2+-зависимых пор [10-14]. Известно, что открытие Са2+-зависимых пор приводит к выходу из митохондрий проапоптотических белков, таких как цитохром c и др., что указывает на их участие в апоптозе [15-17]. С этой точки
ВЛИЯНИЕ ТАУРИИА НА СИСТЕМУ ТРАНСПОРТА ИОНОВ
963
зрения, таурин как природный метаболит также вызывает интерес. В последние годы появляются работы, свидетельствующие о защитном действии таурина, предотвращающем ишемиче-ски-индуцируемый апоптоз в культуре кардио-миоцитов [18] или апоптоз, индуцируемый различными неблагоприятными факторами, такими как окислительный, фотохимический стресс и др. в различных культурах клеток [19,20].
Исследования по влиянию таурина на ми-тохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал в доступных нам литературных источниках не обнаружены. Не проводились также исследования по влиянию таурина на образование Са2+-зависимых пор во внутренней мембране митохондрий. С учетом вышеизложенного, целью настоящей работы было изучение влияния физиологических концентраций таурина на АТФ-зависимый транспорт К+ в митохондриях и формирование в мембране митохондрий Са2+-зависимых пор.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Митохондрии выделяли из печени половозрелых белых крыс массой 220 - 250 г общепринятым методом дифференциального центрифугирования [12]. Среда выделения содержала 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES-KOH (рН 7,4). Концентрацию митохондриального белка определяли методом Бредфорд [21].
АТФ-зависимый транспорт К+ в митохондриях, который отражает активность митохондриального АТФ-чувствительного калиевого канала, оценивали методом энергозависимого набухания митохондрий по поглощению при 520 нм с субстратом дыхания сукцинатом в присутствии ротенона. Измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu иУ2401РС (Япония) в термостатируемой кювете при постоянном перемешивании и температуре 26,7°С. Среда инкубации содержала: 50 мМ КС1, 0,5 мМ Mgd2, 5 мМ КН2Р04, 0,1 мМ ЭГТА, 5 мМ HEPES-K0H (рН 7,4), 2 мкМ ротенона, концентрация митохондриального белка 0,125 мг/мл. Реакцию начинали добавлением 5 мМ сукцината, время инкубирования 3 мин. Энергозависимое набухание митохондрий исследовали при добавлении таурина в присутствии и в отсутствие АТФ.
Количество Са2+, необходимого для образования циклоспорин А-чувствительной Са2+-индуцируемой поры (ткос1ю^па1 регтеаЫШу transition роге - МРТ роге), оценивали после массивной загрузки митохондрий печени крысы Са2+. Измерения проводили в термостатируе-
мой кювете при постоянном перемешивании и температуре 26°С с помощью Са2+-селективного электорода. Митохондрии инкубировали в среде, содержащей 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 1 мМ KH2P04, 5 мкМ ЭГТА, 5 мМ сукцината, 1 мкМ ротенона, 10 мМ HEPES-KOH (Ш 7,4). Концентрация митохондриального белка в кювете составляла 1 мг/мл. СаС^ вносили дробными добавками по 20 мкМ в среду инкубации каждые 60 с. После нескольких добавок Са2+ концентрация внешнего Са2+ в инкубационной среде с митохондриями резко увеличивалась, что свидетельствовало о массивном выходе иона из органелл вследствие образования МРТ-поры во внутренней мито-хондриальной мембране. Количество Са2+, необходимого для массивного выхода иона из органелл, использовали для оценки образования в митохондриях МРТ-поры, обозначенного как Са2+-емкость.
Набухание митохондрий, наблюдаемое при индукции МРТ-поры и циклоспорин А-нечув-ствительной пальмитат/Са2+-активируемой поры, определяли по поглощению при 540 нм в термостатируемой кювете, при постоянном перемешивании и температуре 25°С, на спектрометрической оптоволоконной оптической установке «Осеап 0ptics USB 2000» (Осеап 0ptics, 1пс, США). Среда инкубации содержала 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 5 мкМ ЭГТА, 5 мМ сукцината, 1 мкМ ротенона, 10 мМ HEPES-K0H, pH 7,4. В экспериментах по изучению образования пальмитат/Са2+-активируе-мой поры среда инкубации была дополнена 1 мкМ циклоспорина А. Концентрация митохон-дриального белка в кювете 0,4 мг/мл. Скорость набухания митохондрий (Гтах = ДА 540 мин-1-мг-1 белка) рассчитывали по изменению поглощения в течение первых 30 с от начала высокоамплитудного набухания.
Использовали реактивы: цитохром с, АТФ, АДФ HEPES, трис, сахарозу, KH2P04, Ма^Р04, ЭГТА, ЭДТА, пальмитиновую кислоту, сукцинат, циклоспорин А, ротенон производства Sigma (США), маннитол, Kd, СаС^ - Мегск (Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние таурина на АТФ-зависимый транспорт К+ в митохондриях. По литературным данным таурин дозозависимо блокирует цито-Катф-каналы в области концентраций 10-5 -10-1 М. Наиболее эффективными являются физиологические концентрации (10 и 20 мМ), которые блокируют калиевые каналы в кардио-миоцитах соответственно на 50 и 100% [2,6-9].
Таблица 1. Влияние таурина на энергозависимое набухание митохондрий печени крыс в присутствии АТФ
Рис. 1. Влияние таурина на энергозависимое набухание митохондрий печени крыс. Реакционная среда инкубации митохондрий: 50 мМ КС1, 5 мМ ЫаН2Р04; 0,5 мМ ]^С12, 5 мМ НЕРЕБ, рН 7,4, 0,1 мМ ЭГТА, 5• 10-3 М сукцината, 10-6 М ротенона, белка 0,132 мг/мл. Время инкубации 3 мин, температура 26,7°С. Представлены средние данные пяти опытов (п = 5). За 100% приняты скорости в контроле, составляющие 160 - 260 АА 520 мин-1 •мг-1 белка.
Ориентируясь на эти данные, мы использовали концентрации таурина в диапазоне от микро-до миллимолярных. На рис. 1а показано, что малые концентрации таурина, 0,05 - 125 мкМ, активировали энергозависимое набухание митохондрий. Следует отметить, что степень активирования варьировала в разных опытах и зависела от скорости набухания митохондрий в контроле. Максимальное активирование, до 40%, выявлялось при низких скоростях - 150 - 180 АА 520 мин-1-мг-1 белка, при высоких скоростях (вышеуказанных) стимулирующие эффекты были минимальными.
На рис. 1б видно, что таурин в миллимо-лярных концентрациях практически не оказывал кого-либо действия на энергозависимое набухание митохондрий. Таким образом, физиологические концентрации таурина, 10 и 20 мМ, которые блокировали цито-Катф, оказались не эффективными в наших опытах.
Условия V набухания*, %
Контроль 100 ± 15
АТФ, 50 мкМ 43 ± 12 (-57)
АТФ, 50 мкМ; Таурин, 0,5 мкМ 42 ± 10 (-58)
АТФ 50 мкМ; Таурин, 125 мМ 37 ±5 (-63)
АТФ, 50 мкМ; Таурин, 20 мМ 36 ± 13 (-64)
АТФ, 300 мкМ 0,0 (-100)
АТФ, 300 мкМ; Таурин, 0,5 мкМ 0,0 (-100)
АТФ, 300 мкМ; Таурин, 20 мМ 0,0 (-100)
Таурин, 0,5 мкМ 117 ± 12
Таурин, 125 мкМ 130 ± 11
Таурин, 20 мМ 100 ± 5
Для более полной оценки действия
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.