МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 443-448
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.41.017.6
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН НА РОСТ АЭРОБНЫХ АЛКАЛОТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ГИДРОТЕРМ БУРЯТИИ
© 2004 г. С. В. Зайцева, Л. П. Козырева*, Б. Б. Намсараев
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ Поступила в редакцию 13.10.03 г.
Определены температурные и рИ-параметры роста для коллекционных культур аэробных бактерий - деструкторов органического вещества. Обработка экспериментальных данных с использованием модели Россо позволила рассчитать возможные предельные значения температуры и рИ среды для роста культур и выделить три группы культур по отношению к температуре и рИ. Первую группу термоалкалотолерантных бактерий представляют культуры с минимальными температурами роста <20, оптимумом 38-40 и максимумом 60-64°С и оптимальными значениями рИ 8.0-8.5. Вторую группу составляют истинные алкалотермофилы с оптимумом температуры 45-50°С и оптимальными значениями рИ 8.5-9.0. В третьей группе оказалась культура термофильного алкало-толерантного микроорганизма.
Ключевые слова: гидротермы, алкалотермофилы, математические модели.
Последние два десятка лет микробные сообщества экстремальных местообитаний привлекают пристальное внимание исследователей [1]. Особый интерес в этой связи представляют микробные сообщества щелочных гидротерм. В щелочных гидротермах Иеллоустонского Национального парка, Японии, Исландии, Новой Зеландии исследован видовой состав микробных сообществ и выявлен ряд новых таксонов и видов [2-4].
Микробные сообщества щелочных (pH 8.5-9.95) азотных термальных (30-79°С) источников, расположенных на территории Бурятии в Байкальской рифтовой зоне, до последнего времени изучались эпизодически. В некоторых термальных щелочных источниках побережья озера Байкал изучены фототрофные микробные сообщества, получены и исследованы штаммы термофильных микроорганизмов [5]. Определено количество и видовое разнообразие микроорганизмов, участвующих в процессах продукции и деструкции органического вещества, измерены скорости продукционных и деструкционных процессов [6, 7].
Нами были выделены штаммы бактерий различных физиологических групп и создана рабочая коллекция культур аэробных гетеротрофных бактерий, растущих в широком диапазоне температуры и pH среды. Однако оставалось не вполне ясно, являются ли эти изоляты алкалотермофи-лами или только термо- и алкалотолерантными микроорганизмами.
Целью данной работы являлось исследование влияние температуры и pH на рост коллекционных
* Адресат для корреспонденции (e-mail: klp@biol.bsc.buryatia.ru).
культур аэробных гетеротрофных бактерий из микробных сообществ щелочных гидротерм Бурятии. Математическое отображение функциональной зависимости роста бактерий от температуры и pH было получено с помощью модели Россо [8].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение физико-химических параметров термальных вод проводили с помощью портативных приборов. Температуру определяли спиртовым термометром, pH - прецизионным pH-мет-ром PRO (Сингапур), минерализацию - тест-кондуктометром TDS-4 (Сингапур). Для выделения культур использовали пробы воды, ила и микробных матов термальных щелочных источников Алла, Гарга, Гусиха, Горячинск и Сея, отобранные в экспедициях 1998-1999 гг.
Выделение штаммов аэробных термофильных бактерий проводили на 4 разных культураль-ных средах состава: 1) (г/л): цитрат Na - 1.29, (NH4)2SO4 - 1.92, KH2PO4 - 9.3, MgSO4 ■ 7H2O - 0.2, глюкоза - 19.0 [9]; 2) (г/л): KH2PO4 - 0.33; NH4Cl -0.33; CaCl2 ■ 6H2O - 0.33; MgCl2 - 0.33; дрожжевой экстракт - 0.5; раствор микроэлементов по Лип-перту - 1 мл, глюкоза 1%, для получения агаризо-ванной среды добавляли 1.5% агара [10]; 3) МПБ и 4) МПА. Необходимое значение pH среды для культивирования устанавливали бикарбонат/карбонатным буфером в соответствии с природными значениями pH. При этом в среду вносили: для pH 8.0 - 10.0 г/л NaHCO3, pH 9.0 - 4.5 г/л NaHCO3 и 2.0 г/л Na2CO3, pH 9.5 - 10.0 г/л NaHCO3 и 2.0 г/л
Ка2С03. Высевы проводили из разведений на плотные агаризованные среды 2 и 4, а также из накопительных культур, полученных при засеве жидких сред первого пересева. Посевы инкубировали при температуре 55°С в течение 2-5 сут. Морфологию штаммов исследовали с помощью микроскопа Р20 БК14 (Польша) при увеличении 1250 раз. Зависимость бактериального роста от концентрации КаС1, гидролиз казеина и крахмала, каталазную реакцию, использование кислот и сахаров исследовали стандартными методами [11]. Тестируемые субстраты: этанол, глицерин, рамнозу, ксилозу, сахарозу, целлобиозу, арабино-зу, глюкозу и маннит - добавляли к основной среде 1 в концентрации 2%. Посевы культивировали при 55°С в течение 2-7 сут. Влияние температуры на рост аэробных гетеротрофов исследовали в температурном градиенте в диапазоне 30-60°С при оптимальных значениях рН среды для каждого штамма. Влияние рН оценивали при температуре 55°С и значениях рН среды 6, 7, 8, 8.5, 9, 9.5 и 10. Необходимое значение рН устанавливали бикарбонат/карбонатным буфером или 1 М раствором НС1. Контроль рН во время культивирования проводили анализатором Эксперт-001 (НПП "Эконикс-Эксперт"). Рост штаммов оценивали по
изменению оптической плотности при 540 нм на КФО в течение одних суток. Посевы проводили в двукратной повторности и для итоговых результатов брали среднее значение. Удельную скорость роста бактериальных культур рассчитывали по общепринятой формуле [12]. Для оценки оптимальных и максимально/минимально возможных значений температуры и рН для роста термофильных бактерий экспериментальные данные аппроксимировали в соответствии с моделью Россо [8]. Изменение максимальной удельной скорости роста как функция температуры и рН описывается следующим уравнением:
цтах(Т, рН) = цор4т(Т)р(рН),
где т(Т) - функция температуры, р(рН) - функция рН.
Преобразование этого уравнения в вид:
Мтах (Т) =
0, Т < Тт1п
Мор^( Т), ТтШ < Т < Тт
0 Т > Т
тах
где
т( Т) =
(Т-Т )(Т-Т ■ )2
у-1 тах/\А тт/
( Topt Ттт)[( Topt Т тт)( Т ТорЛ ( Topt Ттах)( ТоР1: + Ттт 2 Т) ]
ор1
ор1
ор1
ор1
носит название модель основных температур и связывает оптимальную удельную скорость роста цшах при температуре Тор1, а также минимальную, оптимальную и максимальную температуры (Ттт, Тор1, Ттах) с максимальной удельной скоростью роста Мшах при температуре Т. За Тор1 принимали такое значение температуры, при котором средняя удельная скорость роста была максимальной.
Изменение ^ах как функции от рН называется "модель основных рН" и оперирует тремя значениями рН: рН,,,,,,, рНор1 и рНшах. Уравнение имеет вид:
'рН < рНтШ, 0.0
Мтах(РН) = \ МoptP(РН^ РНтт < РН < PHmax, РН > РНтах,
где
Р(РН) =
( РН-РНт1п)(РН-РН тах
(РН - РНт1п)(РН - РНтах) - (РН - PHopt)
2'
Для вычисления Тш,, Т^, Т,» и pHшiI1, pHotp, рНшах использовали метод наименьших квадратов, при этом минимизировали сумму квадратов. Оценку точности аппроксимации проводили, вычисляя
стандартное квадратичное отклонение а, выраженное в процентах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследуемые щелочные гидротермы Бурятии характеризовались следующими физико-химическими параметрами. Температура в местах отбора проб варьировала от 30 до 79°С, рН от 8.1 до 9.9. Максимальные значения температуры (74-79°С) зафиксированы в воде Аллинского и Гаргинского источников. рН источников варьировала от слабощелочных значений (8.1-8.5) в воде источников Гусихинский и Гаргинский до сильнощелочных рН (9.9) в пробах Аллинских источников. В высокотемпературных источниках отмечены наиболее низкие значения БИ. Минерализация воды во всех источниках невысока и составляла 0.1-0.8 г/л.
Из проб было выделено 37 штаммов аэробных гетеротрофных бактерий. Для данной работы были отобраны 9 штаммов, активно растущих при высоких значениях температуры и щелочной реакции среды. Штаммы изолированы из гидротерм с различным температурным режимом и различной (от слабощелочной до сильнощелочной) реакцией среды. Характеристика мест отбора проб дана в табл. 1.
Таблица 1. Краткая характеристика мест отбора проб
Источник Тип пробы T, °C pH Eh Минерализация Культура
Алла Бело-серый мат 45 9.20 - 0.3 Bg-10
Гарга Грифон, среднезернистый песок 74 8.19 - 0.8 Bg-24
Гарга Желто-зеленый цианобактериальный мат 68 8.40 - 0.6 Bg-26
Гусиха Желто-зеленый цианобактериальный мат 48 9.00 + 128 0.1 Bg-44
Горячинск Серый песок 45 8.50 +65 0.4 Bg-50
Сея Придонный цианобактериальный мат 49 9.85 -74 0.3 Se-1
Сея Поверхностный цианобактериальный мат 49 9.85 -74 0.3 Se-2
Сея Оранжево-зеленый тонкий мат 45 9.80 +22 0.3 Se-3
Сея Толстый многослойный мат 43 9.75 +60 0.3 Se-4
Таблица 2. Физиолого-биохимическая характеристика выделенных штаммов
Культура Bg-10 Bg-24 Bg-26 Bg-44 Bg-50 Se-1 Se-2 Se-3 Se-4
Т опт 40 45 38 40 45 45 50 40 45
рИопт 8.0 7.5 8.0 8.0 9.0 8.5 9.0 8.5 8.0
Окраска по Граму + + + + + + + + +
Использование спиртов
и сахаров:
этанол + + + + - + - - +
глицерин + + + - - - - - +
рамноза - + + - - - - + +
ксилоза + + + + + - + + +
сахароза + + + + + + + + +
целлобиоза + + + + + + + + +
арабиноза - - - - - - - - -
глюкоза + + + + - + + + +
маннит + + + - + - + - +
Отношение к [КаС1]
2.5% + + + + + + + + +
6.5% +/- +/- - - - - - - +
Отношение к 02 ф. ан. обл. аэр. ф. ан. ф. ан. обл. аэр. обл. аэр. обл. аэр. ф. ан. обл. аэр.
Гидролиз казеина - - + + + - + + +
Тест на каталазу + + + + + + + + +
Гидролиз крахмала + + + + + + + + +
Примечание. Обл. аэр. - облигатный аэроб, ф. ан. - факультативный анаэроб.
стика выделенных штаммов дана в табл. 2. На основании выполненных тестов штаммы были отнесены к роду Bacillus. Экспериментально определенный температурный диапазон развития штаммов находится в интервале от 30 до 60°C, с оптимумом 40-50°C. Диапазон pH - от 5.5 до 10.0, при оптимальных значениях 7.5-9.0.
Термофильные бациллы, составляющие "группу 5" по классификации Эша с соавт. [13], характеризуются более высокими температурными ха-
Выделенные штаммы представлены грамполо-жительными неподвижными образующими терминальные споры, палочками, длиной 6-8 мкм, шири
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.