ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2008, том 42, № 4 (приложение), с. 115-117 СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК "НАНОФОТОНИКА"
ФОТОНИКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ И СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ
УДК 541.14+543.42
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН-СРЕДЫ НА J-АГРЕГАЦИЮ 9-ЭТИЛТИА- И ОКСАКАРБОЦИАНИНОВ В ПРИСУТСТВИИ
ПОЛИПЕПТИДОВ
© 2008 г. А. К. Чибисов, Т. Д. Славнова
Центр фотохимии Российской академии наук 119421, Москва, ул. Новаторов, 7а E-mail: chibisov@photonics.ru Поступила в редакцию 28.11.2007 г.
Ранее нами было показано, что образование I-агрегатов сульфопропил 9-этилтиакарбоцианинов в водных растворах в присутствии одно-, двух- и трехвалентных ионов металлов происходит через димеры, тогда как в случае сульфопропил-9-этил-оксакарбоцианинов - через мономеры красителей [1, 2]. Промежуточной стадией .[-агрегации является образование ионной пары между анионом диме-ра или мономера красителя и катионом металла. Образование .[-агрегатов наблюдали также для сульфопропил 9-этилтиа- и оксакарбоцианинов в водных растворах в присутствии полипептидов (желатина, рибонуклеаза, лизоцим и трипсин) [3, 4]. Было установлено, что .[-агрегаты образуются в результате кооперативного связывания молекулы красителя с полипептидом, где движущей силой является электростатическое взаимодействие с положительно заряженными аминокислотными
остатками полипептидов. При установлении механизма .[-агрегации важно выяснить, в мономерной или димерной форме участвуют молекулы красителей при образовании .[-агрегата в присутствии полипептидов. Кроме того, важно найти пути управления процессом .[-агрегации.
В настоящей работе приведены результаты исследования температурной и рН-зависимостей скорости и выхода .[-агрегатов сульфопропил-9-этилтиа- и оксакарбоцианинов в водных растворах в присутствии желатины, лизоцима и трипсина.
Исследовали 9-этилтиакарбоцианины (Кр1, Кр2) и 9-этилоксакарбоцианин (Кр3). Растворы в воде готовили путем 100-1000-кратного разбавления концентрированного раствора Кр1-Кр3 в диметилсульфоксиде.
Концентрация рабочих растворов составляла 2-10 мкмоль/л. Использовали деионизированную щелочную желатину (IAG № 69827), применяемую для фотографических целей, а также лизоцим ("Fluka") и трипсин ("Sigma") в качестве полипептидов. Воду очищали через систему милли-пор (milli Q).
Разрешенные во времени спектры поглощения J-агрегатов, а также кинетику J-агрегации из-
меряли на спектрофотомере HP 8453. Несколько микролитров раствора полипептида впрыскивали с помощью шприца Hamilton в кювету (1 см) с раствором красителя (2.5 мл) с последующим быстрым перемешиванием в течение 1с, предшествующим спектральным измерениям. рН раствора изменяли впрыскиванием в кювету определенного объема НС104 и/или NaOH, обеспечивающего соответствующее значение рН.
115
8*
116
ЧИБИСОВ, СЛАВНОВА
(dA/dr)MaKC(c !)
0.04
0.02
a1 ■ 2
30 40
Температура, °C
50
Рис. 1. Зависимость от температуры максимальной скорости .Т-агрегации для Кр2 (1) и Кр3 (2) при рН 6 в присутствии 0.0025 и 0.01 вес. % соответственно.
В качестве меры скорости J-агрегации использовали максимальное значение производной от оптической плотности AJ по времени, (dAj/di)MaKC, измеренной в точке перегиба для кинетических кривых сигмоидного типа или в начальный момент для несигмоидных кривых. Дифференцирование кинетических кривых проводили с помощью программы Origin 7.
Повышение температуры раствора приводит к падению скорости образования J-агрегатов в системе Кр2-желатина и ее повышению для Кр3-жела-тина. Влияние температуры на скорость (dAJdt)^^. при условии постоянства концентрации красителей Кр2 и КрЗ и желатины представлено на рис. 1. Температурные коэффициенты, определяемые из наклона прямых, составляют 8 х 10-4 и 2 х 10-3 с1 град-1 для Кр2 и Кр3 соответственно, при этом обе прямые зеркально-симметричны. Изменение температуры и концентрации красителя Кр3 проявляется также в изменении формы кинетической кривой образования J-агрегатов. С ростом температуры происходит переход от сигмойдной к несигмоидной формы кривой (не показано). В отличие от окса-карбоцианина для Кр2 наблюдается несигмоид-ная форма кинетической кривой в широком интервале температуры. В общем случае скорость образования J-агрегатов зависит от константы скорости и концентрации реагентов (димеров или мономеров красителя). В соответствии с уравнением Аррениуса следует ожидать увеличение константы скорости J-агрегации с ростом температуры. Что касается зависимости концентрации реагентов от температуры, то необходимо иметь ввиду, что красители в водном растворе находятся в виде равновесной смеси мономеров и диме-
ров. Положение равновесия существенно зависит от температуры, и поскольку изменение свободной энергии димеризации отрицательно [5], то с повышением температуры равновесие смещается в сторону мономеров. Следовательно, в случае, когда мономеры красителя выступают в качестве реагента, скорость .Т-агрегации должна возрастать с увеличением температуры. Действительно, положительный температурный коэффициент для Кр3 указывает на то, что образование Т-агре-гатов происходит через мономеры красителя, так же как и в случае .Т-агрегации этого красителя в присутствии ионов металлов [2]. В отличие от Кр3 краситель Кр2 характеризуется отрицательным температурным коэффициентом аналогично красителю Кр1, измеренным в присутствии ионов металлов [2]. Падение скорости I-агрегации для системы Кр2-желатина с увеличением температуры указывает на то, что уменьшение концентрации реагента превалирует над ожидаемым увеличением константы скорости. Отсюда следует вывод о том, что при .Т-агрегации Кр2 в качестве реагента выступают димеры красителя.
В общем случае кинетическая кривая образования Т-агрегатов описывается протяженной экс-понентой [3, 4, 6, 7]
Aj = A0 + (A7 - A0){1-exp(-kt)n},
(1)
где А0 и А 7 - поглощение Т-агрегатов сразу же после впрыскивания раствора полипептида (0) и после завершения процесса .Т-агрегации соответственно, к - экспериментально определяемая константа скорости Т-агрегации, п - подгоночный параметр при проведении процедуры фитинга.
Как было указано выше, форма кинетической кривой образования Т-агрегатов зависит от температуры. С ростом температуры индукционный период сокращается, и сигмоидная кривая превращается в кривую, имеющую несигмоидную форму. Причиной этого является увеличение концентрации мономеров в результате диссоциации димеров. Этот результат коррелирует со значениями к и п в выражении для протяженной экспоненты (1). Величина к увеличивается на два прядка с ростом температуры от 27 до 53°С, тогда как п уменьшается в пять раз.
Таким образом, изучение температурной зависимости скорости Т-агрегации показало, что образование Т-агрегатов на желатине происходит через мономерную форму для Кр3 и димерную форму для Кр2.
Полипептиды являются полиэлектролитами, содержащими как положительно, так и отрицательно заряженные аминокислотные остатки, и их общий заряд существенно зависит от рН среды. В этой связи можно ожидать, что скорость Т-агрегации и выход Т-агрегатов будет зависеть от
0
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН-СРЕДЫ
117
кислотности среды. Нами было показано, что (йЛ[/йг)макс, а также для Кр2 и Кр3 в присутствии желатины резко возрастает при снижении рН от 6 до 4, что обусловлено увеличением числа положительно заряженных аминокислотных остатков в результате их протонирования [3]. В случае лизо-цима образование .[-агрегатов для Кр1 происходит в нейтральных или слабощелочных растворах и практически не имеет места при рН > 11 [4]. рН-Зависимость для системы Кр1 - трипсин смещена в сторону более нейтральной среды с точкой перегиба при рН 4.5. Ярко выраженная рН-зависимость выхода .[-агрегатов может быть использована для управления процессом [-агрегации. Зависимость от времени выхода .[-агрегатов для системы Кр1 - трипсин до и после добавления НС104, соответствующая скачку рН от 6.2 до 3.3, представлена на рис. 2. Отметим, что кинетическая кривая для димеров зеркально симметрична кривой для .[-агрегатов (не показано). Изменение рН раствора приводит к быстрому образованию [-агрегатов и одновременному падению выхода димеров с последующим возвращением к исходному состоянию при добавлении КаОН (увеличение рН до 10.9). Последующее (через 960 с) впрыскивание НС104 снижает рН до 3.4 и повторно увеличивает выход .[-агрегатов. Аналогичные результаты были получены для Кр3 и желатины при чередовании значений рН от 5.6 до 4.4. Таким образом, впрыскивание Н+/ОН-, изменяющее рН раствора, позволяет управлять выходом .[-агрегатов красителей в присутствии полипептидов.
Таким образом в данной работе рассмотрено влияние температуры и рН на кинетику [-агрегации сульфопропил 9-этилтиа- и оксакарбоциани-новых красителей (Кр1, Кр2 и Кр3) в водных растворах в присутствии полипептидов - желатины, лизоцима и трипсина. С ростом температуры скорость образования [-агрегатов увеличивается для системы Кр3-желатина и уменьшается для Кр2-желатина. Повышение температуры приводит к смещению равновесия димер-мономер красителей в сторону мономеров. Падение концентрации димеров Кр2 и уменьшение скорости [-агрегации указывает, что образование [-агрегатов происходит через димерную форму красителя в отличие от Кр3, где [-агрегация протекает через мономеры красителя. Изменение рН водного раствора вызывает ускорение или замедление [-агрегации для всех изученных систем краситель-полипептид, что позволяет управлять процессом [-агрегации.
Aj 0.9
0.6
0.3
3.3
3.4
-
- 10.9
6.2 Н-В-1 МЧШ111 1
10.7
200
400 600 Время, с
800
1000
Рис. 2. Зависимость Л. (■) от времени для системы Кр1-трипсин до (рН 6.2) и после впрыскивания Н+ = = 100 с, рН 3.3), ОН- (Г = 300 с, рН 10.9), Н+ (Г = 550 с, рН 3.4), ОН- (Г = 800 с, рН 10.7).
Авторы благодарны проф. Б.И. Шапиро за любезное предоставление цианиновых красителей и проф. X. Гёрнеру за обсуждение результатов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-03-32298) и Немецкого исследовательского объединения (грант DFG № 436).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Chibisov AK, Görner H, Slavnova TD. //
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.