БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2007, № 4, с. 88-96
УДК 591.132:05+597.5
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ, pH И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА РЫБ БЕНТО- И ПЛАНКТОФАГОВ
© 2007 г. В. В. Кузьмина, Н. В. Ушакова
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, e-mail: vkuzmina@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 31.07.2006 г.
Выявлена разная степень влияния природных (температура, pH) и антропогенных (Zn, Cu) факторов на активность протеиназ слизистой оболочки пищеварительного тракта бенто-(лещ, плотва), планктофагов (синец, уклейка) и факультативного планктофага тюльки. Протеиназы слизистой оболочки желудка (тюлька) более устойчивы к действию исследованных факторов, чем протеиназы слизистой оболочки кишечника. Степень воздействия температуры, pH и тяжелых металлов на активность пищеварительных гидролаз зависит от вида рыб, сочетания и вариабельности значений отдельных факторов.
ВВЕДЕНИЕ
Продуктивность водных экосистем в значительной степени зависит от эффективности функционирования пищеварительных гидролаз рыб. Протеазы играют особую роль в процессах пищеварения рыб, поскольку в их пище доминируют белковые компоненты [8]. Один из наиболее важных факторов, влияющих на эффективность питания рыб и активность пищеварительных ферментов, - температура. В многочисленных работах показано, что ферменты рыб способны функционировать в зоне низких температур, причем температурные характеристики ферментов отражают особенности биологии, связанные с температурой среды их обитания [16]. На активность ферментов влияет также рН среды. Панкреатические протеиназы рыб, обеспечивающие начальные этапы гидролиза белка, как правило, стабильны при рН 59.9, а оптимум рН варьирует от 5.7 до 9.5 [4, 17, 23]. У некоторых видов рыб (карп, линь, серебряный карась, белый толстолобик) оптимум рН протеиназ соответствует 10 [4, 17, 22]. При этом рН энте-ральной среды в процессе пищеварения может значительно меняться. Так, у дорады в среднем отделе кишечника в первые 6 ч рН увеличивается от 7.1 до 7.6, через 10 ч снижается до 7.2, через 12 ч снова повышается до 7.7. В заднем отделе кишечника рН изменяется от 6.9 до 7.9 [21].
В последние десятилетия особое внимание уделяется влиянию на пищеварительные ферменты рыб загрязняющих веществ, в частности тяжелых металлов (ТМ), высокие концентрации которых негативно действуют на ферментные системы рыб, в том числе гидролазы пищеварительного тракта [8, 9, 11]. Вместе с тем ранее, как правило,
исследовалось раздельное влияние отдельных природных и антропогенных факторов на ферментативную активность. Сейчас значительное внимание уделяется изучению сочетанного влияния различных факторов на активность ферментов, обеспечивающих деградацию белковых и углеводных компонентов пищи [16]. При исследовании влияния температуры, pH и кадмия на активность некоторых протеиназ и карбогидраз выявлены существенные различия их раздельного и сочетанного эффектов [3, 7, 8, 10]. Сведения о раздельном и комплексном влиянии температуры, pH и TM (Zn и Cu) на активность протеиназ, реализующих начальные этапы гидролиза белка у бен-то- и планктофагов, отсутствуют.
Цель работы - изучить раздельное и комплексное влияние температуры, pH и TM (Cu, Zn) на активность протеиназ слизистой оболочки кишечника у ряда массовых видов пресноводных костистых рыб, относящихся по типу питания к группе бенто-и планктофагов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа проведена в 2004-2006 гг. Объекты исследования - взрослые особи леща Abramis brama (L.) (масса 920 ± 54 г), синца Abramis ballerus (L.) (масса 285 ± 13 г), плотвы Rutilus rutilus (L.) (масса 324 ± 38 г), тюльки Clupeonella cultriventris Nordm. (масса 12.3 ± 3 г) и уклейки Alburnus alburnus (L.) (масса 9.7 ± 2.3 г), обитающие в Рыбинском водохранилище.
Рыб после поимки в течение 1-2 ч доставляли в лабораторию, где помещали на стекло ледяной бани. Затем извлекали кишечник и специальным
скребком снимали слизистую оболочку. Готовили суммарные пробы, в состав которых входила слизистая от 5-10 экз. рыб одного вида. Слизистую тщательно перемешивали и отбирали аликвоту для приготовления исходного гомогената. Гомоге-наты готовили с помощью стеклянного гомогенизатора, добавляя охлажденный до 2-4°C раствор Рингера для холоднокровных животных (109 мМ NaCl, 1.9 мМ KCl, 1.1 мМ CaCl2, 1.2 мМ NaHCO3) в соотношении 1:49, pH 5.0, 7.4 и 8.5. Для оценки влияния Zn и Cu на активность пищеварительных гидролаз в пробирки приливали 0.25 мл раствора соли TM (CuSO4 ■ 5H2O или ZnSO4 ■ 7H2O) в концентрации 10 мг/л в расчете на содержание ионов металла и 0.25 мл гомогената. Содержимое пробирок инкубировали при температуре 0, 10, 20 и 37°C в течение 1 ч при непрерывном перемешивании. В каждую пробирку добавляли 0.5 мл субстрата. Содержимое пробирок вновь инкубировали при той же температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Активность протеиназ определяли по приросту тирозина методом Ансона [18] в некоторой модификации. Для определения активности протеиназ желудка (преимущественно пепсин, КФ 3.4.23.1) использовали 1%-ный раствор гемоглобина. Для определения активности протеиназ кишечника использовали два субстрата - 1%-ные растворы гемоглобина и казеина. В первом случае выявляли активность химотрипсина (КФ 3.4.21.1), во втором - активность трипсина (КФ 3.4.21.4). Количество продуктов реакции (тирозин) определяли с помощью фотоэлектроколориметра КФК-2 (длина волны 587 нм). Активность ферментов определяли в пяти повторностях для каждой точки с учетом фона (количество соответствующих компонентов в исходном гомогенате). Данные обрабатывали статистически с использованием пакета прикладных программ EXCEL и ANOVA с последующей оценкой различий с помощью LSD-теста, p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бентофаги (лещ, плотва). Уровень активности протеиназ кишечника по казеину (АПК) при стандартных значениях температуры (20°C) и pH (7.4) у леща в 3.9 раза ниже, чем у плотвы, по гемоглобину (АПГ) - лишь в 1.9 раза. Результаты изучения раздельного влияния температуры, pH, Zn и Cu на уровень активности исследованных протеиназ в слизистой оболочке кишечника этих видов свидетельствуют о том, что наибольшее влияние на активность ферментов оказывает температура (табл. 1-3). Действительно, при pH 7.4 повышение температуры от 20 до 37°C увеличивает АПК и АПГ у леща почти на 200%, у плотвы - на 79 и 90%. При снижении температуры от 20 до 0°C АПК у обоих видов уменьшается на 80%, АПГ - на 43 и 63% соответственно. Под действием Zn (20°C,
рН 7.4) АПК и АПГ, как правило, снижаются на 40%, под влиянием Си - на 60-70% (исключение АПК у плотвы). При уменьшении рН от 7.4 до 5.0 АПК у обоих видов снижается на 30%, АПГ -на 15%, при увеличении рН до 8.5 наблюдается значительное возрастание только АПГ у леща (на 60%).
При сочетанном действии исследованных факторов уровень активности ферментов наиболее значительно изменяется при действии температуры и рН. При температуре 0°С и рН 5.0 АПК у обоих видов рыб уменьшается на 85%, АПГ - на 50 и 75% у леща и плотвы соответственно. При сочетанном действии температуры 37°С и рН 8.5 АПК у леща увеличивается на 195%, у плотвы - на 70%, АПГ - на 240 и 110% соответственно. При сочетанном действии температуры 0°С, а также Zn и Си АПК и АПГ у обоих видов снижается на 8090%. При увеличении рН до 8.5 АПК, как правило, изменяется незначительно (в пределах 20%), у леща в присутствии Си снижается на 35%. АПГ при тех же значениях рН в присутствии Zn у леща несколько увеличивается, в остальных случаях уменьшается (максимум на 37%).
При сочетанном действии всех исследованных факторов отмеченные выше ингибиторные эффекты усиливаются. При этом величина эффекта не зависит от характерного для вида уровня ферментативной активности. При температуре 0°С и рН 5.0 в присутствии обоих металлов АПК и АПГ у плотвы, а также АПК у леща в присутствии Си снижается на 90%. В остальных случаях у леща активность снижается не более, чем на 70%.
Планктофаги (синец, уклейка). Уровень АПК при температуре 20°С и рН 7.4 у синца в 2.2 раза ниже, чем у уклейки, АПГ - близки (табл. 3-5). При рН 7.4 уменьшение температуры до 0°С приводит к снижению АПК у обоих видов рыб на 75%, повышение температуры до 37°С, напротив, к увеличению на 145 и 44% у синца и уклейки соответственно. АПГ при понижении температуры снижается на < 50%, при повышении - увеличивается на 180 и 270%. При снижении рН до 5.0 АПК уменьшается на 50-70%, при повышении до 8.5 у синца увеличивается на 40%, у уклейки - фактически не меняется. Степень изменения АПГ под влиянием рН у обоих видов близка: в зоне кислых значений рН ферментативная активность снижается на 20-30%, в зоне щелочных - увеличивается почти на 40%. Металлы в меньшей степени влияют на ферментативную активность по сравнению с другими факторами. В присутствии Zn у обоих видов рыб АПК не изменяется, в присутствии Си -снижается на < 35%. АПГ у синца под влиянием Zn и Си снижается на 10 и 20% соответственно, у уклейки - на 55%.
При бифакторном воздействии температура и рН, как и у бентофагов, оказывают наиболее зна-
Таблица 1. Влияние температуры, рН, Zn и Си на активность (мкмоль/(г • мин)) протеиназ слизистой оболочки кишечника бентофагов по казеину
Объект исследования Температура, °C pH
5 7.4 8.5
Zn
Abramis brama 0 0. 4 9 ± 0.07 0. 2 1 ± 0.04 0. 7 0 ± 0.11 0. 2 8 ± 0.08 0. 7 8 ± 0.09 0. 46 ± 0.03
10 1. 04 ± 0.07 0. 80 ± 0.03 1. 74 ± 0.07 1. 2 5 ± 0.08 3. 20 ± 0.08 2. 92 ± 0.08
20 2. 4 3 ± 0.13 1. 60 ± 0.13 3. 82 ± 0.13 2. 3 6 ± 0.08 4. 5 2 ± 0.13 3. 3 4 ± 0.11
37 5.91 ± 0.13 2. 7 8 ± 0.11 10. 92 ± 0.07 8 .48 ± 0.08 11. 26 ± 0.14 9 .59 ± 0.14
Rutilus rutilus 0 2. 2 3 ± 0.16 1. 67 ± 0.16 3. 20 ± 0.14 2. 6 4 ± 0.14 3. 8 9 ± 0.16 3. 3 4 ± 0.16
10 3. 7 5 ± 0.14 3. 27 ± 0.13 5. 0 1 ± 0.16 4. 3 1 ± 0.14 6. 9 5 ± 0.23 6. 1 2 ± 0.16
20 10. 2 9 ± 0.23 9 .45 ± 0.16 15. 0 1 ± 0.16 14. 1 8 ± 0.23 17. 3 8 ± 0.27 15. 40 ± 0.23
37 15. 9 9 ± 0.27 14. 87 ± 0.27 25.72 ± 0.27 24. 6 1 ± 0.27 Cu 25.72
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.