ВОПРОСЫ ИХТИОЛОГИИ, 2007, том 47, № 4, с. 566-573
УДК 597.5.591.132.05
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ, рН И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ (МЕДЬ, ЦИНК) НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА ТИПИЧНЫХ И ФАКУЛЬТАТИВНЫХ ИХТИОФАГОВ
© 2007 г. В. В. Кузьмина*, Н. В. Ушакова
Институт биологии внутренних вод РАН - ИБВВ, Борок Ярославской области * E-mail: vkuzmina@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 04.07.2006 г.
Установлены значительно большие видовые различия в уровне казеин- и гемоглобинлитической активности протеиназ слизистой оболочки кишечника по сравнению с активностью гемоглобинли-тических протеиназ слизистой оболочки желудка, а также разная степень влияния природных (температура, рН) и антропогенных (цинк, медь) факторов на активность исследованных гидролаз у щуки Esox lucius, судака Stizostedion lucioperca, налима Lota lota и окуня Perca fluviatilis. Наиболее устойчивы к действию исследованных факторов протеиназы слизистой оболочки желудка, особенно у щуки, наименее устойчивы казеинлитические протеиназы кишечника (за исключением ферментов окуня). Степень воздействия температуры, рН и тяжелых металлов зависит от вида рыб, сочетания (моно-, би- или полифакторное) и вариабельности значений отдельных факторов.
Как известно, протеазы играют особую роль в процессах пищеварения рыб, особенно ихтиофагов, поскольку в тканях объектов их питания преобладают белковые компоненты (Шатуновский, 1980; Кузьмина, 2005). Также известно, что рыбы, будучи пойкилотермными животными, подвержены значительному влиянию температуры и опосредованно других факторов среды. Существуют многочисленные данные, касающиеся влияния температуры (KaláC, 1978; Simpson, Haard, 1985; Кузьмина, 1990; Пономарев, 1993; Dimes et al., 1994; Kristjánsson et al., 1995; Hidalgo et al., 1999; Bendiksen et al., 2003) и рН (KaláC, 1978; Simpson, Haard, 1985; Dimes et al., 1994; Kristjánsson et al., 1995; Hidalgo et al., 1999; Chong et al., 2002; Deguara et al., 2003; Улитина, 2005) на активность протеиназ у типичных и факультативных ихтиофагов. В меньшей степени исследовано влияние на ферменты цепи протеаз тяжелых металлов. Однако в настоящее время не вызывает сомнения, что цинк и медь, будучи жизненно необходимыми (Алабастер, Ллойд, 1984; Watanabe et al., 1997; Остроумова, 2001), в определённых концентрациях становятся токсичными (Алабастер, Ллойд, 1984; Мур, Рамамурти, 1987). В связи с усиливающимся антропогенным влиянием на водные экосистемы возникает опасность их негативного воздействия на пищеварительные ферменты. Действительно, показано, что тяжелые металлы снижают активность протеиназ и карбо-гидраз как в условиях in vivo (Sastry, Gupta, 1979; Gupta, Sastry, 1981; Kuz'mina et al., 1999), так и в условиях in vitro (Golovanova et al., 1999; Туктаров,
2002; Кузьмина и др., 2003). Изучение влияния тяжелых металлов на процессы пищеварения представляет особый интерес, поскольку известно о преимущественном их поступлении с кормом рыб (Kamunde et al., 2002; Bury et al., 2003). Важно отметить, что ранее, как правило, исследовалось раздельное влияние указанных выше факторов на активность пищеварительных гидролаз. Вместе с тем установлено, что температура влияет на рН-функцию ферментов (Кузьмина, 1984), а рН -на температурную зависимость протеиназ (Munil-la-Moran, Sebarido-Rey, 1996). Ранее при исследовании сочетанного влияния температуры, рН и кадмия на активность протеиназ у ряда видов пресноводных костистых рыб была установлена как значительная вариабельность эффектов в зависимости от их сочетания, так и существенные отличия эффектов раздельного действия каждого из исследованных факторов (Кузьмина, 1997). Аналогичные данные были получены при исследовании раздельного и комплексного влияния тяжелых металлов на активность карбогидраз (Голованова, 1997, 2006; Кузьмина и др., 1999). Кроме того, следует подчеркнуть, что снижение активности протеиназ, уменьшающее поступление продуктов гидролиза белковых компонентов корма во внутреннюю среду организма рыб, отрицательно влияет не только на трофическую, но и другие, в частности - защитную, трансформационную и регуляторную, функции пищеварительных гидролаз (Кузьмина, 1999, 2005).
Цель работы состояла в изучении раздельного и комплексного влияния температуры, рН и тя-
желых металлов (медь, цинк) на уровень активности гемоглобин- и казеинлитических протеиназ, обеспечивающих процессы полостного и мембранного гидролиза белковых компонентов пищи у ряда массовых видов пресноводных костистых рыб, относящихся по типу питания к группам типичных и факультативных ихтиофагов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа проведена в 2003-2006 гг. Объекты исследования - половозрелые особи 4 видов рыб: щука Esox lucius (масса 950 ± 120 г), судак Stizoste-dion lucioperca (1130 ± 56 г), налим Lota lota (620 ± 70 г) и окунь Perca fluviatilis (128 ± 35 г), отловленные в Рыбинском водохранилище. Пойманных рыб в течение 1-2 ч доставляли в лабораторию, где у них на холоду изымали желудочно-кишечный тракт и специальным скребком снимали слизистую оболочку желудка и кишечника. Готовили суммарные пробы, в состав которых входила слизистая от 3-5 экз. одного вида. Слизистую тщательно перемешивали и отбирали аликвоту для приготовления исходного гомогена-та. Гомогенаты готовили при помощи стеклянного гомогенизатора, добавляя охлажденный до 2-4°С раствор Рингера для холоднокровных животных (109 mM NaCl, 1.9 mM KCl, 1.1 mM CaCl2, 1.2 mM NaHCO3) в соотношении 1 : 49. Определение проводили в широком диапазоне значений рН: 3.0, 4.0 и 5.0 - для протеиназ желудка, 5.0, 7.4 и 8.5 - для протеиназ кишечника. Для оценки влияния цинка и меди на активность пищеварительных гидролаз в пробирки приливали 0.25 мл раствора соли тяжелого металла (CuSO4 ■ 5H2O или ZnSO4 ■ 7H2O) в концентрации 10 мг/л и 0.25 мл гомогената. Затем содержимое пробирок инкубировали при температуре 0, 10, 20 и 37°С в течение 1 ч при непрерывном перемешивании. После этого в каждую пробирку добавляли 0.5 мл субстрата, и содержимое пробирок вновь инкубировали в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Активность протеиназ определяли по приросту тирозина методом Ансона (Anson, 1938) в некоторой модификации. Для определения гемоглобин-литической активности ферментов желудка (преимущественно пепсин, КФ 3.4.23.1) и кишечника (преимущественно химотрипсин, КФ 3.4.21.1) использовали 1%-ный раствор гемоглобина. Для определения казеинлитической активности (преимущественно трипсин, КФ 3.4.21.4) использовали 1%-ный раствор казеина. Ферментативную активность определяли в 4 повторностях для каждой точки с учетом фона и выражали в мкмоль/(г ■ мин). Данные обрабатывали статистически с использованием приложения EXCEL программы MS Of-fice'XP и ANOVA. Достоверность результатов оценивали при уровне значимостиp < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Раздельное и сочетанное влияние температуры, рН и тяжелых металлов на активность гемо-глобинлитических протеиназ слизистой оболочки желудка рыб. Полученные данные свидетельствуют, что в период активного питания (щука, судак и окунь - в июне, налим - в феврале) уровень гемоглобинлитической активности при стандартных значениях температуры (20°С) и рН (3.0) у щуки в 2 раза выше, чем у других исследованных видов рыб (рис. 1). При этом на величину показателя большее влияние оказывает интенсивность, чем тип питания. Так, у типичного ихтиофага судака и факультативных ихтиофагов налима и окуня активность близка - соответственно 7.51, 7.66 и 8.28 мкмоль/(г • мин), у типичного ихтиофага щуки в период наиболее интенсивного питания - 14.96 мкмоль/(г • мин). При стандартных значениях рН (3.0) температура оказывает незначительное влияние на ферментативную активность. При температуре 0°С уровень активности протеиназ у всех видов рыб достоверно снижается на 22-27% (таблица). рН оказывает различное влияние на ферментативную активность у рыб разных видов: при температуре 20°С у щуки при рН 5.0 активность снижается на 5%, у судака - на 25%, у налима - на 30%, у окуня - на 70%. Металлы меньше влияют на ферментативную активность по сравнению с природными факторами. В присутствии цинка активность снижается на 6-8%, в присутствии меди - на 8-12%.
При сочетанном воздействии природных факторов наиболее значительно уровень гемоглобинлитической активности снижается при температуре 0°С и рН 5.0: у щуки на 34%, у судака и налима на 52%, у окуня на 79%. В присутствии цинка при температуре 0°С ферментативная активность у налима снижается на 27%, у окуня - на 35%, у щуки и судака - на 30% по сравнению со стандартными значениями. В присутствии меди в тех же условиях в наибольшей степени активность снижается у щуки (на 36%), в наименьшей - у окуня (на 28%).
При сочетанном воздействии природных и антропогенных факторов отмеченные выше инги-биторные эффекты усиливаются. Наиболее устойчивыми оказались протеиназы желудка щуки: при температуре 0°С, рН 5.0 и в присутствии цинка ферментативная активность снижается на 38%, в присутствии меди - на 40%. Наименее устойчивы ферменты желудка окуня. В тех же условиях в присутствии цинка ферментативная активность снижается на 94%, в присутствии меди -на 95%. У двух других видов активность протеиназ уменьшается на 56-65%, причем эффекты меди несколько выше эффектов цинка. Увеличение температуры до 37°С приводит к значительному снижению эффектов рН и тяжелых металлов.
(а) (б)
Рис. 1. Раздельное и сочетанное влияние температуры, рН, меди и цинка на гемоглобинлитическую активность про-теиназ слизистой оболочки желудка щуки Esox lucius (а), судака Stizostedion lucioperca (б), налима Lota lota (в), окуня Perca fluviatilis (г). 1 - контроль, 2 - Zn (10 мг/л), 3 - Cu (10 мг/л).
В присутствии металлов у большинства исследованных видов рыб устойчивость ферментов повышается приблизительно в 2 раза, у щуки в присутствии меди - в 6 раз, в присутствии цинка снижение активности не выявлено.
Раздельное и сочетанное влияние температуры, рН и тяжелых металлов на активность казеин- и гемоглобинлитических протеиназ слизистой оболочки кишечника рыб. Результаты опытов по раздельному и комплексному
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.