ВОПРОСЫ ИХТИОЛОГИИ, 2007, том 47, № 6, с. 837-846
УДК 597.5.591.132:05
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ, РН И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ (МЕДЬ, ЦИНК) НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ
ОБЪЕКТОВ ПИТАНИЯ ТИПИЧНЫХ И ФАКУЛЬТАТИВНЫХ ИХТИОФАГОВ
© 2007 г. В. В. Кузьмина*, Н. В. Ушакова
Институт биологии внутренних вод РАН - ИБВВ, Борок Ярославской области * E-mail: vkuzmina@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 12.09.2006 г.
Исследовано раздельное и комплексное влияние температуры, рН и тяжелых металлов (медь, цинк) на уровень активности казеин- и гемоглобинлитических протеиназ в целом организме ряда видов рыб (окуня Perca fluviatilis, ерша Gymnocephalus sernuus, плотвы Rutilus rutilus, тюльки Clupeonella cultriventris, карпа Cyprinus carpio, а также сеголеток сем. карповых (Cyprinidae) (суммарно)), доминирующих в пище типичных и факультативных ихтиофагов. Установлено, что при снижении температуры до 0°С и в присутствии металлов (цинк, медь) в концентрации 10 мг/л у всех видов рыб наблюдается достоверное снижение казеин- и гемоглобинлитической активности. При уменьшении и увеличении рН казеинлитическая активность изменяется в меньшей степени, причем степень изменения ферментативной активности варьирует у рыб разных видов. Гемоглобинлитическая активность при уменьшении значений рН, как правило, значительно, при увеличении - незначительно возрастает. При сочетанном воздействии природных факторов, а в ряде случаев и при сочетанном влиянии низкой температуры и металлов казеинлитическая активность изменяется в большей степени, чем при их раздельном действии. Полифакторные эффекты в большинстве случаев ниже бифакторных эффектов температуры и металлов.
Ранее были установлены значительные видовые различия в уровне казеин- и гемоглобинлитической активности протеиназ слизистой оболочки кишечника рыб-ихтиофагов, а также разная степень влияния природных (температура, рН) и антропогенных (цинк, медь) факторов на активность исследованных ферментов. Кроме того, была выявлена меньшая устойчивость казеинли-тических протеиназ слизистой оболочки кишечника по сравнению с гемоглобинлитическими протеиназами (Кузьмина, Ушакова, 2007).
Вместе с тем в последние годы значительное внимание уделяется роли ферментов объектов питания в процессах пищеварения рыб (Dabrows-ki, Glogowski, 1977; Dabrowski, 1979; Кузьмина, 1990; Oozeki, Bailey, 1995). Благодаря разработке принципиально новых подходов к оценке роли ферментов жертвы в процессах пищеварения консументов (Кузьмина, 2000; Кузьмина и др., 2004) была выявлена возможность значительного вклада протеиназ объектов питания в гидролиз белковых компонентов пищи в желудке рыб (Кузьмина, 2000; Скворцова, 2002; Kuz'mina, Golovanova, 2004). При этом определялась только гемоглобинлитическая активность во всем организме у плотвы Rutilus rutilus и окуня Perca fluviatilis. Вместе с тем известно, что уровень активности как протеаз пищеварительного тракта (Fange, Grove, 1979; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина,
2005), так и активность лизосомальных гидролаз, разрушающих те же субстраты (Немова, 1996), у рыб разных видов значительно варьирует. Известно также, что протеиназы пищеварительного тракта рыб, особенно кишечника, подвержены значительному влиянию температуры (Кузьмина, 1990; Пономарев, 1993; Уголев, Кузьмина, 1993; Hidalgo et al., 1999; Bendiksen et al., 2003), рН (Hidalgo et al., 1999; Улитина, 2005) и тяжелых металлов (Sastry, Gupta, 1979; Gupta, Sastry, 1981; Kuz'mina et al., 1999; Туктаров, 2002; Кузьмина, Ушакова, 2007). При этом практически не исследовано влияние этих факторов на протеазы потенциальных объектов питания рыб-ихтиофагов. Известно лишь о значительном увеличении активности гемоглобинлитических протеиназ объектов питания (рыб и хирономид) ихтиофага-фа-культативного бентофага окуня при увеличении температуры от 0 до 20°С и рН от 5.0 до 8.3 (Кузьмина и др., 2004). Сведения о раздельном и сочетанном влиянии температуры, рН и тяжелых металлов на активность казеин- и гемоглобинлитических протеиназ потенциальных объектов питания рыб отсутствуют. Однако в связи с усиливающимся влиянием тяжелых металлов на водные экосистемы возникает опасность их негативного воздействия не только на пищеварительные ферменты консумента, но и на многочисленные пищеварительные и лизосомальные гидролазы объектов питания рыб. Поскольку протеиназы
жертвы вносят значительный вклад в процессы пищеварения ихтиофагов, снижение их активности может отрицательно влиять не только на трофическую, но также и на защитную, регулятор-ную и трансформационную функции пищеварительных гидролаз рыб (Кузьмина, 2005).
Цель работы состояла в изучении раздельного и комплексного влияния температуры, рН и тяжелых металлов (медь, цинк) на уровень активности казеин- и гемоглобинлитических протеиназ в целом организме ряда видов рыб, доминирующих в пище типичных и факультативных ихтиофагов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа проведена в летний период 2004-2006 гг. Объекты исследования: неполовозрелые особи 5 видов рыб трех семейств: Percidae - окунь Perca fluviatilis (масса 3.4 ± 0.6 г), ерш Gymnocephalus sernuus (2.8 ± 0.6 г); Clupeidae - тюлька Clupeonella cultriventris (1.4 ± 0.4 г); Cyprinidae - плотва Rutilus rutilus (4.7 ± 0.3 г), карп Cyprinus carpio (2.3 ± 0.8 г), а также сеголетки (суммарно) карповых видов рыб (0.2 ± 0.03 г). Все рыбы, за исключением прудового карпа, отловлены в Рыбинском водохранилище. После поимки рыб в течение 1-2 ч доставляли в лабораторию. Рыб на холоду измельчали и готовили суммарные пробы, в состав которых обычно входило 5-15 особей одного вида, в суммарные пробы сеголеток - до 50-60 особей разных видов рыб сем. карповых (преимущественно плотва, синец Abramis ballerus, густера Blicca bjoerkna, лещ Abramis brama). Пробы тщательно перемешивали и отбирали аликвоту для приготовления исходного гомогената. Гомогена-ты готовили при помощи стеклянного гомогенизатора, добавляя охлажденный до 2-4°С раствор Рингера для холоднокровных животных (109 мМ NaCl, 1.9 мМ KCl, 1.1 мМ CaCl2, 1.2 мМ NaHCO3) в соотношении 1:49. Определение проводили в широком диапазоне значений температуры (0, 10, 20 и 37°С) и рН (3.0, 5.0, 7.4 и 8.5) в отсутствие и присутствии меди (CuSO4 • 5H2O) или цинка (ZnSO4 • • 7H2O) в концентрации 10 мг/л. Схема эксперимента была описана ранее (Кузьмина, Ушакова, 2007). Активность протеиназ определяли по приросту тирозина (Ансона, 1938) в некоторой модификации. Для определения казеинлитической активности (преимущественно трипсин, КФ 3.4.21.4 и лизосомальные катепсины КФ 3.4.12-3.4.14, 3.4.21-3.4.23) использовали 1%-ный раствор казеина. Для определения гемоглобинлитической активности (преимущественно пепсин КФ 3.4.23.1, химотрипсин КФ 3.4.21.1 и лизосомальные катепсины КФ 3.4.12-3.4.14, 3.4.21-3.4.23) использовали 1%-ный раствор гемоглобина. Ферментативную активность определяли в 5 повторностях для каждой точки с учетом фона и выражали в мкмоль/г • мин. Данные обрабатывали статистически
с использованием приложения EXCEL программы MS Office'XP и ANOVA. Достоверность результатов оценивали при уровне значимости p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Раздельное и сочетанное влияние температуры, рН и тяжелых металлов на активность казеинлитических протеиназ в целом организме рыб
Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее высокий уровень казеинлитической активности при стандартных значениях температуры (20°С) и рН (7.4) характерен для плотвы и окуня - 1.01 и 1.39, несколько ниже у ерша и сеголеток карповых рыб - 0.92 и 0.72, наиболее низкий у тюльки и карпа - 0.37 и 0.22 мкмоль/г • мин (рис. 1, 2). При повышении температуры во всем исследованном диапазоне рН ферментативная активность достоверно увеличивается. Так, например, при рН = 7.4 уровень активности протеиназ при 20° по сравнению с таковым при 0°C возрастает: у карповых рыб в 1.9-2.8, у ерша в 1.9, у тюльки в 5.3 раза. Влияние рН на ферментативную активность у разных рыб видов не однонаправленное. При рН 5.0 (20°C) у плотвы, сеголеток карповых рыб и ерша активность снижается в 1.2-2.1 раза, у остальных видов увеличивается в 1.4-2.0 раза по отношению к стандартным значениям. При рН 8.5 у большинства видов рыб активность протеиназ несколько увеличивается, у окуня - практически не изменяется. Металлы в разной степени влияют на ферментативную активность. При рН 7.4 в присутствии цинка у представителей Cyprinidae активность снижается в 2.0 раза, у окуневых и сельдевых - в 1.3 раза; в присутствии меди - соответственно в 2.4 и 1.7 раза; при рН 5.0 - соответственно в 1.6 и 1.7 и в 2.7 и 1.9 раза.
При сочетанном действии природных факторов (температура 0°C и рН 5.0) наблюдается разная степень снижения уровня казеинлитической активности. Если у сеголеток карповых рыб активность снижается до 0, у плотвы - в 4.8, у ерша -в 3.4 раза, то у карпа, окуня и тюльки - лишь в 1.2-1.9 раза. При температуре 0°C и щелочных значениях рН в большинстве случаев степень снижения ферментативной активности существенно ниже, чем при кислых значениях, однако у сеголеток карповых рыб наблюдается некоторое увеличение ферментативной активности. В результате этого у большинства видов рыб при 0°C в зоне щелочных значений рН активность в 1.5-2 раза выше, чем в зоне кислых значений, а у окуня, напротив, в 2.5 раза ниже. Во всех указанных случаях изменения ферментативной активности достоверны (табл. 1). При сочетанном действии цинка и температуры 0°С ферментативная активность у всех видов рыб уменьшается значительнее: у представителей сем. карповых в 3.3-5.5, у ерша -
(а)
U1 2 3
t, °C
t, °C 20
t, °C
pH
Рис. 1. Раздельное и сочетанное влияние температуры, рН, меди и цинка на казеинлитическую активность протеиназ целого организма: а - плотвы Rutilus rutilus, б - сеголеток Cyprinidae (суммарно), в - карпа Cyprinus carpió. 1 - контроль, 2 - Zn (10 мг/л), 3 - Cu (10 мг/л).
в 4.2, у окуня - в 5.8, у тюльки - в 9.3 раза по фект возрастает: у представителей сем. карповых сравнению со стандартными значениями. В при- активность снижается в 5.5-11.0, у ерша - в 5.8, у сутствии меди в тех же условиях негативный эф- тюль
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.