РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 2
= ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВЛИЯНИЕ ТН1/ТН2-ПОЛЯРИЗУЮЩИХ АГЕНТОВ - ДЕГИДРОЭПИ-АНДРОСТЕРОНА СУЛЬФАТА И МУРАМИЛДИПЕПТИДА - НА МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ МАКРОФАГОВ
© 2009 г. В.О. Ткачев, Н.Н. Вольский, О.Т. Кудаева, О.П. Колесникова, В.А. Козлов
ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск, Россия Поступила: 02.02.2009. Принята: 12.05.2009
В экспериментах in vivo и in vitro изучено влияние дегидроэпиандростерона сульфата (DHEA-S) и мурамилдипептида (MDP), обладающих оппозитными эффектами на Th1/ ТЬ2-баланс, на активность NO-синтазы и аргиназы в макрофагах мышей (C57Bl6xDBA/2) F1. Установлено, что DHEA-S изменяет метаболическое состояние макрофагов в сторону преобладания NO-синтазной активности, способствуя, тем самым, активации клеток по классическому механизму. MDP, напротив, увеличивает активность аргиназы in vivo, что свидетельствует об альтернативной активации макрофагов. Эффекты дегидроэпиандростерона и мурамилдипептида могут быть тесно связаны с их оппозитным влиянием на Th1/ та2-девиацию иммунного ответа.
Ключевые слова: макрофаги, дегидроэпиандростерона сульфат, мурамилдипептид, аргиназа, оксид азота.
ВВЕДЕНИЕ
Макрофаги и дендритные клетки, «дирижирующие» дифференцировкой Т-лимфоцитов, могут находиться в различных метаболических состояниях, в частности, отличаться особенностями метаболизма L-аргинина в клетках, что тесно связано с их иммунорегуляторными свойствами. Развитие Th1-опосредованного иммунного ответа in vitro сопровождается индукцией гена индуцибельной NO-синтазы (iNOS) в антиген-презентирующих клетках [1], при этом синтезируемый данным ферментом из аргинина оксид азота способствует дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в Thl-клетки [2]. При Тк2-зависимых иммунных процессах наблюдается увеличение активности аргиназы, причем конечные продукты данного пути метаболизма L-аргинина — про-лин и полиамины — способствуют клеточной пролиферации (в том числе и пролиферации клеток-антителопродуцентов), разрешению острой воспалительной реакции и репарации тканей [3, 4].
При изучении хронической реакции трансплантат против хозяина (РТПХ), индуцированной переносом полуаллогенных лимфоид-
Адрес: 630099 г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. E-mail: tkachev_victor@mail.ru
ных клеток от мышей линии DBA/2 гибридам первого поколения B6D2F1, было выявлено существование двух ее альтернативных иммунопатологических вариантов, характеризующихся преимущественной активацией различных субпопуляций Т-хелперов [5]. Введение мышам дегидроэпиандростерона сульфата (DHEA-S) на этапе индукции существенно увеличивает частоту развития Thl-зависимого варианта хронической РТПХ. Мурамилдипептид (MDP), напротив, оказывает Тк2-поляризующее действие на иммунные процессы в описанной модели [6, 7].
До настоящего времени клеточные и молекулярные механизмы влияния DHEA-S и MDP на ТЫ/1Ъ2-баланс в организме остаются до конца не изученными. Во многих случаях эффекты дегидроэпиандростерона (в том числе на иммунную систему) противоположны действию глюкокортикоидных гормонов. Известно, что глюкокортикоиды снижают экспрессию гена индуцибельной NO-синтазы, но усиливают экспрессию гена аргиназы II типа [8, 9]. В настоящее время регуляторное действие DHEA-S на метаболизм L-аргинина в макрофагах практически не изучено, но можно предположить, что и в данном случае его эффекты будут противоположны влиянию глюкокортикоидов. Согласно литературным данным [10, 11], мурамилдипептид in vitro уве-
личивает синтез оксида азота макрофагами, что входит в явное противоречие с его известным Тп2-поляризующим эффектом [7, 12] и требует дальнейших исследований. Влияние MDP на аргиназную активность остается до настоящего времени не исследованным.
В связи с вышеизложенным, представляло интерес оценить влияние DHEA-S и MDP на активность NO-синтазы и аргиназы в макрофагах in vivo и in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные.
В работе использовали гибридных мышей (C57Bl/6xDBA/2)F1 (B6D2F1), самок, в возрасте 2 — 6 месяцев, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН.
Выделение и культивирование резидентных перитонеальных макрофагов.
Мышам после декапитации в полость брюшины вводили 10 мл холодной культуральной среды RPMI-1640 (ГНЦ ВБ Вектор) c 1% фе-тальной бычьей сывороткой (FCS; Биолот), через 2 минуты клетки перитонеального экссудата извлекали при помощи шприца. Полученные клетки отмывали и культивировали в 96-луночном планшете (Orange scientific, Бельгия) по 200 х 103 клеток на лунку в течение 2 часов в полной культуральной среде, приготовленной на основе RPMI-1640 (без фенолового красного) и содержащей 10% FCS, 15 мМ Hepes (Sigma, США), 0,3% L-глютамина (ГНЦ ВБ Вектор). После этого неприлипаю-щую фракцию удаляли двукратной отмывкой теплой средой RPMI-1640. Полученные таким образом перитонеальные макрофаги культивировали в течение 24 часов (для определения активности аргиназы), либо 48 часов (для определения продукции оксида азота) в полной культуральной среде. Для активации NO-синтазы в начале культивирования добавляли LPS (E. Coli B5 : 055) в конечной концентрации 10 мкг/мл (Sigma, США) и LPS в сочетании с содержащим IFNy. В качестве источника IFNy использовали супернатант смешанной культуры лимфоцитов, полученным стандартным методом [13].
Схемы опытов
В опытах in vitro DHEA-S в конечной концентрации 200 мкМ и MDP в конечных концентрациях 5 и 10 мкг/мл вносили к клеточным
культурам в начале срока культивирования. В опытах in vivo DHEA-S вводили мышам за 12 и 24 часа до выделения макрофагов в дозе 0,75 мг/мышь. MDP вводили мышам за 24 часа до выделения макрофагов в дозе 0,05 мг/ мышь.
Продукцию оксида азота оценивали по содержанию нитритов в супернатанте клеточных культур [14]. Спустя 48 часов из лунок культурального планшета отбирали по 100 мкл супернатанта и смешивали с равным объемом реактива Грисса (Fluka). Пробы выдерживали в темноте 15 минут, после чего определяли оптическую плотность при длине волны 540 нм.
Активность аргиназы определяли микрометодом по скорости образования мочевины из экзогенного L-аргинина [15]. Для этого макрофаги лизировали 0,1% раствором Triton X100, после чего к 50 мкл лизата добавляли 50 мкл 50 мМ Tris-HCl (pH 7,4) и 10 мкл 50 мМ раствора хлорида марганца. Аргиназу активировали нагреванием на водяной при +57 °С в течение 10 минут, добавляли к пробам по 100 мкл 0,5 М раствора L-аргинина и инкубировали их 1 час при +37 °С. Реакцию останавливали добавлением H2SO4/H3PO4/H2O (в объемном соотношении 1 : 3 : 7). Концентрацию мочевины определяли колориметрически при длине волны 540 нм после добавления альфа-изонитрозопропиофенона (9% спиртового раствора) и нагревания на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Результат выражали в mU активности фермента. За 1 U активности аргиназы принимали количество фермента, синтезирующего 1 ммоль мочевины в минуту.
Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Отличия между сравниваемыми величинами показателей различных экспериментальных групп считали достоверными при p < 0,05. Результаты на графиках и в таблицах приведены в виде средних величин.
Работа выполнена с использованием технической базы Центра коллективного пользования СО РАМН.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В условиях in vivo DHEA-S, введенный в дозе, оказывающей ТЫ-поляризующее влияние на иммунные реакции (0,75 мг/мышь), многократно усиливает LPS-стимулированную продукцию NO. Она возрастала в 2,8 раза при
- * **
1 1 1
Контроль (п = 8) 12ч (п = 8) 24ч (п = 8)
Рис. 1. Влияние DHEA-S на LPS-стимулированную продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей in vivo
По оси абсцисс: время после введения гормона По оси ординат: концентрация нитритов (мкМ) *отличия между опытной и контрольной группами достоверны с p < 0,05.
**отличия между опытной и контрольной группами достоверны с p < 0,01.
введении гормона за 12 часов и в 3,6 раза при введении гормона за 24 часа до выделения макрофагов (рис. 1). Продукция оксида азота, стимулированная LPS в сочетании с IFNy в условиях данного эксперимента не изменялась (данные на рисунках не приведены). На активность аргиназы в макрофагах введение DHEA-S за 12 и 24 часа до выделения клеток не оказывает заметного влияния (таб. 1).
Спустя 24 часа после введения интактным мышам MDP не влияет на продукцию оксида азота —как спонтанную, так и стимулированную различными активаторами (данные на рисунках не представлены). В тот же срок MDP увеличивает активность аргиназы в клетках на 44% по сравнению с контролем (таб. 2).
Таблица 1. Влияние DHEA-S на активность аргиназы (в mU) в макрофагах in vitro и in vivo
Условия эксперимента Экспериментальные группы
In vitro Контроль (n = В) DHEA-S 200 м^ (п = В)
В33 2В0*
In vivo Контроль (п = В) DHEA-S 12 часов (п = В) DHEA-S 14 часов (п = В)
1290 1342 1676
*отличия между опытной и контрольной группами достоверны с p < 0,05.
Таблица 2. Влияние MDP на активность аргиназы (в mU) в макрофагах in vitro и in vivo
Условия эксперимента Экспериментальные группы
In vitro Контроль (n = В) MDP 5 мкг/мл (n = В) MDP 10 мкг/мл (n = В)
690 71В 525
In vivo Контроль (n = В) MDP 24 часа (n = В)
692 992*
отличия между опытной и контрольной группами достоверны с p < 0,05.
Таблица 3. Влияние DHEA-S на продукцию оксида азота (в мкМ нитритов) in vitro
Экспериментальные
Стимулятор продукции NO группы
Контроль (n = В) DHEA-S (200 м^) (n = В)
LPS 4 3
LPS/IFNy 36,5 29,6*
отличия между опытной и контрольной группами достоверны с p < 0,05.
Как следует из полученных данных, влияние DHEA-S и MDP in vivo на особенности метаболизма L-аргинина в макрофагах совпадают с их противоположно направленными эффектами на ТЫ/1Ъ2-баланс в иммунной системе. Однако проведенные опыты не дают представления о непосредственных клеточных мишенях действия этих соединений: возможно, часть наблюдаемых эффектов обусловлена воздействием DHEA-S и/или MDP не на макрофаги, а на другие клетки иммунной системы. Поэтому для уточнения ме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.