ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 5, с. 508-516
УДК 576.32.36:582.282.23
Посвящается светлой памяти И.С. Кулаева
ВЛИЯНИЕ ТОЧЕЧНЫХ ЗАМЕН ОСТАТКОВ Асп-714 И Асп-720 НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ И+-АТФазы ПЛАЗМАЛЕММЫ ДРОЖЖЕЙ
© 2014 г. В. В. Петров*, Р. И. Ибрагимов**
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина, Пущино, 142290
e-mail: vpetrov07@gmail.com **Башкирский государственный университет, Уфа, 450076 Поступила в редакцию 24.01.2014 г.
Трансмембранные сегменты M5 и M6, участвующие в образовании сайтов транспорта катионов в Н+-, Ca2+-, K+,Na+-, Н+,К+- и других Р2-АТФазах, связаны между собой короткой экстрацитозоль-ной петлей. В относящейся к этому типу Н+-АТФазе плазмалеммы дрожжей, петля связана с М5 и М6 через остатки Асп-714 и Асп-720. Представлены результаты сравнительного изучения влияния точечных замен этих остатков на Ала, Вал, Асн и Глу на функционирование фермента. Только при замене остатка Асп-714 на Асн синтезировался мутант, активность которого была близка активности дикого типа, в то время как остальные мутации Асп-714 вызывали серьезные нарушения биогенеза и были неактивны. Все мутантные ферменты с заменами Асп-720 экспрессировались на значительном уровне и были активны. Наблюдали значительное уменьшение экспрессии, активности и транспорта Н+ и его сопряжения с гидролизом АТФ у мутанта, содержащего замену D720V. Таким образом, все замены Асп-714, кроме D714N, серьезно нарушали биогенез и/или функционирование фермента, что позволило предположить важную роль этого остатка для биогенеза, стабильности структуры и функционирования фермента.
DOI: 10.7868/S0555109914050079
Н+-АТФаза (КФ 3.6.1.3) плазматической мембраны дрожжей (Рта1) относится к широко распространенной и физиологически важной группе Р2-АТФаз, к которой относятся К+,№+-, Н+,К+-и Са2+-АТФазы, использующие энергию гидролиза АТФ для транспорта различных моно- и ди-валентных катионов через клеточные и внутриклеточные мембраны прокариотических и эукари-отических клеток [1]. Н+-АТФаза плазмалеммы является жизненно необходимым ферментом [2], генерирующим электрохимический градиент протонов, за счет энергии которого функционируют различные вторичные транспортные системы и поддерживается ионный гомеостаз и внутриклеточный рН. Количество этого фермента составляет до 25% от количества белков плазматической мембраны. Р2-АТФазы имеют одну главную каталитическую субъединицу, встроенную в липид-ный бислой посредством десяти трансмембранных гидрофобных сегментов [3], которые связаны между собой короткими экстрацитозольными и более длинными цитозольными петлями. Эти сегменты образуют мембранный домен фермента, в котором находятся остатки, участвующие в транспорте катионов. Р2-АТФазы обладают об-
щим каталитическим механизмом, при котором АТФ фосфорилирует консервативный аспартат-ный остаток с образованием макроэргического ин-термедиата [4]. Стехиометрия катионного транспорта различается у различных представителей этого семейства: от 1—2 Н+/АТФ у протонных насосов плазматических мембран грибов и растений [5—7] до 3 Na+/2 К+/АТФ у Ш+,К+-АТФаз животных клеток [8]. Во время реакционного цикла Р2-АТФазы претерпевают существенные конформационные изменения, при которых трансмембранные сегменты М1—М6 частично разворачиваются и даже выходят из мембраны [3].
Дрожжи и другие грибы (Saccharomyces, Pichia, Yarrowia, Aspergillus), будучи продуцентами ценных биологически-активных веществ, являются важным объектом биотехнологических производств. Некоторые из них (Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis) могут вызывать оппортунистические инфекции или порчу продуктов (Zygosaccharomyces, Saccharomyces, Ustilago). Однако они являются удобной моделью для изучения гомологичных ферментов животных и растительных клеток. Так, изучение свойств Н+-АТФазы
плазматической мембраны клеток грибов и дрожжей необходимо при разработке способов предотвращения порчи продуктов [9, 10] или подборе фун-гицидных средств [11]. Новые штаммы дрожжей, содержащие Pmal АТФазу с повышенной стехиометрией транспорта [6, 7], могут быть использованы для повышения эффективности биотехнологических производств (например, синтез органических кислот), для создания экологически безопасных фунгицидных препаратов и/или их тестирования. Ранее было показано, что замены аминокислотных остатков N-концевой части М6 существенным образом влияли на биогенез и/или функционирование Pmal АТФазы дрожжей [12, 13]. Так, замена D714A в петле, связывающей сегменты М5 и М6, приводила к нарушению биогенеза фермента и потере активности, а замена D720A — к уменьшению активности фермента более, чем в 2 раза [14].
Настоящая работа является продолжением систематического исследования Pma1 Н+-АТФазы дрожжей [6, 7, 12—17].
Цель работы — выяснение роли реакционно-активных остатков Асп-714 и Асп-720, находящихся на границе водной и мембранной фаз, в структурно-функциональной организации фермента.
МЕТОДИКА
Штамм дрожжей. В работе использовали штамм дрожжей S. cerevisiae SY4 (MATa; ura3-52; leu2-3, 112; his4-619; sec6-4; GAL; pma1::YIpGAL-PMA1) [15], в котором присутствовали хромосомная (PMA1) и плазмидная (pmal) копии гена, кодирующего Pma1 Н+-АТФазу. В этом штамме хромосомная копия гена АТФазы дикого типа находилась под контролем промотора GAL1 (Pgal-PMA1), плазмидная — под контролем индуцируемого тепловым шоком промотора HSE (PHSE-pma1), при этом сам плазмидный ген pma1 был или дикого типа, или мутантный. Штамм SY4 также содержал мутацию в гене SEC6, блокирующую слияние секреторных везикул с плазматической мембраной при тепловом шоке.
Сайт-направленный мутагенез. Для введения мутаций во фрагмент BglII-SalI (519 п.н.) гена pma1, который был предварительно субклониро-ван в модифицированную версию плазмиды Bluescript ("Stratagene", США), использовали ПЦР. Для замены остатков Асп-714 и Асп-720 на Ала, Вал, Глу и Асн были синтезированы олиго-нуклеотиды, содержащие соответствующие замены (табл. 1). По завершении мутагенеза фрагменты секвенировали для подтверждения наличия мутаций и отсутствия нежелательных замен других
Таблица 1. Олигонуклеотиды, синтезированные для замены аминокислотных остатков Асп-714 и Асп-720 на Ала, Вал, Глу и Асн. (Триплеты, кодирующие замены, выделены жирным шрифтом)
Мутация Олигонуклеотид
D714A 5'> CCAAAGAGTTAGCCAAAATAGC <3'
D714V 5'> CCAAAGAGTTAACCAAAATAGC <3'
D714E 5'> CCAAAGAGTTTTCCAAAATAGC <3'
D714N 5'> CCAAAGAGTTGTTCAAAATAGC <3'
D720A 5'> C AATCAAAGCAATGTCCAAAG <3'
D720V 5'> C AATCAAAACAATGTCCAAAG <3'
D720E 5'> C AATCAATTCAATGTCCAAAG <3'
D720N 5'> C AATCAAGTTAATGTCCAAAG <3'
оснований. Затем этими фрагментами с помощью рестрикционных эндонуклеаз BamHI, BglII, HindIII, SacI, Sali и Т4 ДНК-лигазы ("New England Biolabs", США) последовательно замещали соответствующие участки в плазмиде pPMA1.2, несущей полную кодирующую последовательность гена pmal [15]. Для экспрессии Pmal Н+-АТФазы в секреторных везикулах фрагмент HindIII-SacI (3770 п.н.), содержащий кодирующую последовательность гена, с помощью рестрикционных эндонуклеаз HindIII, SacI и Т4 ДНК-лигазы переносили под контроль промотора PHSE-pma1 в центромерную плазмиду YCp2HSE, которой трансформировали штамм SY4.
Выделение секреторных везикул. Для получения секреторных везикул штамм SY4 выращивали при 23°С до середины логарифмической фазы роста на жидкой среде, содержащей 0.67 г/л YNB, 20 мг/л гистидина и 2%-ную галактозу, а затем отмывали от среды с галактозой и переносили на среду, содержащую 2%-ную глюкозу. Через 3 ч инкубации с глюкозой дрожжи подвергали тепловому шоку (39°С), и инкубировали еще 2 ч. Клетки осаждали центрифугированием (5000 g в течение 5 мин), суспендировали в среде, содержащей 1.4 М сорбит и зимолиазу, после чего получали сферопласты, которые обрабатывали конка-навалином А для утяжеления плазматических мембран. Сферопласты механически лизировали в гипоосмотической среде, содержащей 0.4 М сорбит, и после удаления остатков клеток, ядер, митохондрий и плазматических мембран центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин получали мембранную фракцию, обогащенную секреторными везикулами [15, 16], из которой с помощью дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности сахарозы выделяли секреторные везикулы, содержащие вновь синтезированную АТФазу, как описано ранее [6, 15, 16].
M3
M4
M5
M6
M7
M8
G
GIIQ
N
GIV R NG RI Т L RR «SLD (D? ÍD) K P L F G A
AC FY YT L A I L LIV TTMF MNG
LVWT G I Т GLWI FIA WIT L IM FL
A Т LL I IG E I FL I FA A I G S QIS
VLVI VPV S L HL D V A GIV L LT E N
I LL GLP R I AL TLA S I I L WLI
GIGI A VV YVVY I AY D LWGM FIT R
291
NH,
N R
A P
P L
Y N
S W
PKPV K
Цитозоль
107
COOH
Рис. 1. Схема топологии центральной части Рта1 Н+-АТФазы дрожжей 8. сетем181ае, показывающая трансмембранные сегменты М3—М8 и экстрацито-зольные петли между ними. Цифрами обозначено число аминокислотных остатков в большой цито-зольной петле и К- и С- частях фермента. Асп-714 и Асп-720 отмечены кружками.
Экспрессия Pmal АТФазы. Количество экспрес-сированного белка Pmal АТФазы (экспрессию) в секреторных везикулах и других мембранных фракциях определяли с помощью ПААГ-электрофореза в присутствии ДДС-Na и иммуноблоттинга, как описано ранее [15, 16]. Блоты обрабатывали полик-лональными антителами к Pma1 Н+-АТФазе, a затем 1251-белком А ("ICN", США). Уровень экспрессии мутантной Pma1 АТФазы в секреторных везикулах определяли с помощью прибора PhosphorImager, оснащенного программой ImageQuant ("Molecular Dynamics", США) и выражали в процентном отношении от количества фермента в штамме родительского типа, выделяемого параллельно. Для обнаружения мутантных АТФаз, которые не были способны достичь секреторных везикул, клетки SY4 переносили с галактозной на глюкозную среду, как описано выше, и метаболически метили, инкубируя с 3^-метионином. Затем выделяли суммарную мембранную фракцию и обрабатывали ее трипсином в соотношении трипсин : белок 1 : 20. Полученный продукт подвергали ПААГ-электрофорезу в присутствии ДДС-Na, иммунопре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.