БИОХИМИЯ, 2012, том 77, вып. 4, с. 442 - 451
УДК 577.24
ВЛИЯНИЕ ЦЕНТРИНА-2 НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФАКТОРОВ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ С ПОВРЕЖДЕННОЙ ДНК*
© 2012 г. Ю.С. Красикова1, Н.И. Речкунова1, Е.А. Мальцева1, |К.Т. КраескУ 2, И.О. Петрусева1, О.И. Лаврик1**
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8; факс: (383)363-5153, электронная почта: lavrik@niboch.nsc.ru
2 Integrative Imaging Unit, INSERM U759/Institut Curie-Recherche, Centre Universitaire Paris-Sud, Bâtiment 112, 91405 Orsay, France
Поступила в редакцию 01.11.11 После доработки 13.12.11
Исследовано влияние центрина-2 (Cen2) на взаимодействие факторов эксцизионной репарации нуклеоти-дов — XPC-HR23b, RPA и XPA — с 48-мерными ДНК-дуплексами, содержащими производное dUMP (5-{3-[6-(карбоксиамидо-флуоресцеинил)амидокапромоил]аллил}-2'-дезоксиуридин-5,-монофосфат). Остаток флуо-ресцеина, присоединенный к основанию нуклеотида, имитирует объемное повреждение ДНК. Показано, что Cen2 стимулирует связывание и повышает выход белок-нуклеиновых аддуктов ДНК с XPC-HR23b — белком, узнающим объемные повреждения в структуре ДНК. Эффект стимуляции комплексообразования наиболее выражен в присутствии Mg2+ и имеет колоколообразную зависимость от концентрации Cen2. В присутствии Cen2 изменяется стехиометрия комплексов RPA-ДНК и уменьшается выход ковалентных сшивок RPA с ДНК. Обнаружено влияние Cen2 на совместное комплексообразование RPA и XPA с ДНК, выраженное в появлении дополнительных ДНК-белковых комплексов, возможно, включающих центрин-2. Получены данные о существовании прямых контактов Cen2 с ДНК. Результаты настоящих исследований в совокупности с литературными данными позволяют предположить, что Cen2 является регуляторным элементом системы ЭРН.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эксцизионная репарация нуклеотидов, центрин-2, фотоаффинная модификация, комплексообразование белковых факторов репарации с ДНК.
Процесс эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) выполняет в клетке удаление из ДНК объемных повреждений, возникающих под действием факторов окружающей среды, таких как УФ-облучение и химические канцерогены, либо в результате применения химиотера-певтических средств. В процесс ЭРН вовлечено
Принятые сокращения: ЭРН — эксцизионная репарация нуклеотидов; Flu-dUMP — 5-{3-[6-(карбоксиамидо-флуоресцеинил)амидокапромоил]аллил}-2'-дезоксиури-дин-5'-монофосфат; 5I-dUMP — 5-йодо-2'-дезоксиури-дин-5'-монофосфат; Cen2 — центрин-2; RPA — реплика-тивный белок А; XPA — фактор Xeroderma pigmentosum комплементационной группы А; XPC—HR23b — фактор Xeroderma pigmentosum коплементационной группы С в комплексе с гомологом дрожжевого белка Rad23.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 11-294, 19.02.2012.
** Адресат для корреспонденции.
более 30 полипептидов [1], т.е. это сложная надмолекулярная машина, осуществляющая репарацию ДНК с участием ансамбля ферментов и белковых факторов. Позднее были открыты дополнительные белковые факторы, участвующие в этом процессе, часть из которых, скорее всего, выполняет регуляторную роль. К числу таких белков может быть отнесен центрин-2 (Cen2), входящий в состав комплекса с XPC — фактором, осуществляющим первичное узнавание повреждений ДНК в процессе ЭРН [2]. В клетке весь XPC находится в комплексе с двумя белками — HR23b и Cen2. Эти малые субъединицы не имеют ДНК-связывающей активности, однако стимулируют связывание с ДНК основной субъединицы комплекса (XPC), что повышает эффективность реакции ЭРН in vitro и in vivo [3, 4]. В отличие от HR23b, Cen2 не является абсолютно необходимым для протекания процесса ЭРН in vitro и его роль скорее заключается в регуля-
ции функций XPC как сенсора повреждений. Помимо стимуляции связывания XPC с ДНК, HR23b и Cen2 кооперативно стабилизируют XPC [5]. Кроме того, оба белка выполняют ряд регуляторных функций, в том числе связанных с процессом деградации белков протеасомой 26S [6, 7, 8]. Предположительно Cen2 может влиять на взаимодействие XPC с комплексом TFIIH (открыт как фактор транскрипции, transcription factor IIH), в состав которого входят геликазы, ответственные за раскручивание ДНК вокруг повреждения, а, следовательно, контролировать вовлечение TFIIH в процесс ЭРН [4].
Человеческий центрин-2 — небольшой (19,7 кДа), кислый (pI 4,91) Ca2+-связывающий белок, принадлежащий к высококонсервативному суперсемейству кальмодулина. Cen2 состоит из двух доменов, содержащих структурный мотив «спираль-петля-спираль» («EF-hand»). Сайт связывания Ca2+ находится внутри мотива «петля» С-концевого домена белка, и именно этот домен Cen2 вовлечен во взаимодействие с XPC (участок 847—863 а.о.) [9]. Этот участок XPC относится к С-концевому фрагменту (815—940 а.о.), который в обычном состоянии неструктурирован. Однако специфичное связывание с Cen2 индуцирует локальное структурирование 17-звенного пептида XPC (847—863 а.о.), а именно образование а-спирали [10], стабилизируя тем самым структуру XPC. Межмолекулярные контакты в комплексе XPC-Cen2 образованы гидрофобными аминокислотными остатками а-спирали XPC и неполярной поверхностью С-концевого домена Cen2 [11—13].
Пул клеточного Cen2 in vivo распределен между цитоплазмой и клеточным ядром. В цитоплазме центрин-2 связан с центрами организации микротрубочек (центросомами у животных и базальными тельцами у дрожжей) и необходим для нормального удвоения центриолей. Перемещение Cen2 между ядром и цитоплазмой регулируется за счет сумоилирования. Модификация центрина белком SUMO2/3 ведут к накоплению Cen2 в цитоплазме [13]. Только 10% от общего количества Cen2 находится в комплексе XPC-HR23b-Cen2, и в составе этого комплекса он, как было сказано выше, стабилизирует структуру XPC и повышает его сродство к ДНК [4, 14]. Другие функции Cen2, помимо его взаимодействия с центросомами и XPC, остаются неясными. Кроме того, до сих пор нет точного понимания механизма стимулирующего влияния Cen2 на протекание процесса ЭРН.
В настоящей работе мы исследовали влияние Cen2 на взаимодействие ключевых факторов ЭРН - XPC-HR23b, ХРА и RPA - с поврежденной ДНК.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали следующие материалы и реактивы: [у-32Р]-АТР (3000 Ки/ммоль) производства Лаборатории радиохимии ИХБиФМ СО РАН, полинуклеотидкиназа фага Т4 («Биосан»), окрашенные маркеры молекулярной массы белков («Bio Rad»), реактивы для электрофорезов и основные компоненты буферов фирмы «Sigma» или отечественного производства с квалификацией ос.ч. Олигонуклеотиды, содержащие фотоактивный аналог 5I-dUMP либо флуоресцеи-новое производное dUMP, были синтезированы В.Н. Сильниковым («Нанотех-С»). Структуры олигонуклеотидов и аналогов нуклеотидов приведены на рис. 1.
Белковые препараты. Рекомбинантный Cen2 человека был экспрессирован в E. coli и выделен как описано [12]. Для приготовления стокового раствора навеску лиофилизированного белка растворяли в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2. Дальнейшее разведение до необходимой концентрации производили буфером ФВ1 х (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 100 мМ KCl, 1 мМ ДТТ). Рекомбинантный RPA человека был выделен как описано [15]. Рекомбинантный XPA человека, содержащий полигистидиновый фрагмент на ^-кон-це, выделяли как описано [16]. Рекомбинантный гетеродимер XPC-HR23b (Flag-ХРС и 6HisTag-HR23B) был получен по методике, описанной в работе [4], с небольшими модификациями. Рекомбинантные ДНК, кодирующие субъединицы гетеродимера, были любезно предоставлены К. Сугасавой (Kobe University, Япония).
Получение 5'-[32P]-меченых ДНК-дуплексов.
Введение радиоактивной метки в 5'-конец 5I-dUMP-содержащих олигонуклеотидов проводили с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 в соответствии с протоколом [17]. Меченые олигонуклеотиды очищали электрофорезом (ЭФ) в денатурирующем ПААГ с последующей элюци-ей из геля [18]. Для получения ДНК-дуплексов к водному раствору 5'-[32P]-меченого олигонукле-отида добавляли комплементарный олигонук-леотид в соотношении 1 : 1, инкубировали 5 мин при 95°, затем медленно охлаждали до 75°, выдерживали 15 мин при этой температуре, а потом медленно охлаждали до комнатной температуры. Степень гибридизации контролировали в 10%-ном ПААГ (акриламид: бис-акриламид = = 40 : 1). В качестве электродного буфера использовали буфер ТВЕ (50 мМ Tris-На, 50 мМ H3BO3, 1 мМ ЭДТА, рН 8,3).
Комплексообразование белков с ДНК анализировали методом задержки в геле. Реакцию
а
ДНК-дуплекс для экспериментов по связыванию
5'-р*-СТАТ GQCG AGGC GATT AAGT TGGG CAAC GUCA GGGT CTTC CGAA CGAC-3' 3'-GATA CCGC TCCG CTAA TTCA ACCC GFTG CAGT CCCA GAAG GCTT GCTG-5'
ДНК-дуплекс для фоггоаффинной модификации
5'-р*-СТАТ GGCG AGGC GATT AAGT TGGG TAAC GTCA GGGT CTTC CGAA CGAC-3' 3' -GATA CCGC TCCG CTAA TTCA ACCC AlFG CAGT CCCA GAAG GCTT GCTG-5'
б
I: 51-dUMP
5-йодо-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат
F: Flu-dUMP
5-{3-[6-(карбоксиамидофлуоресцеинил)амидо-капромоил]аллил}-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат
Рис. 1. а — Последовательность использованных ДНК-дуплексов; б — структуры аналогов нуклеотидов
проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей буфер ФВ1х, 2 мМ MgCl2 (если реакция проводилась в присутствии Mg2+), 0,6 мг/мл БСА, 1 нМ 5'-[32Р]-меченую ДНК и различные концентрации исследуемых белков. Белки пред-ынкубировали с ДНК при 37° в течение 20 мин. Затем в образцы добавляли буфер нанесения (1/5 объема), содержащий 20% глицерин, 0,015% бромфеноловый синий и буфер ФВ1х (температура буфера нанесения была также 37°). Реакционные смеси наносили на предварительно охлажденные гели (4°). ЭФ проводили в неде-натурирующем 5% ПААГ-ном (акриламид : бис-акриламид = 60 : 1) при постоянном напряжении 17 В/см и температуре 4°. В качестве электродного буфера использовали ТБЕ. Положение радиоактивно меченого олигонуклеотида и белок-нуклеиновых комплексов определяли радиоавтографией с использованием прибора «Molecular imager FX Pro+», «BioRad».
Измерение анизотропии флуоресценции проводили на приборе POLARstar Optima («BMG Labtech», Германия). В качестве флуорофора
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.