РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 4 с. 440-448
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВЛИЯНИЕ ЦЕРЕБРОЛИЗИНА НА НЕКОТОРЫЕ ПАРАМЕТРЫ АПОПТОЗА ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ И АССОЦИИРОВАННЫХ С НИМ ФАКТОРОВ У НОВОРОЖДЕННЫХ С ПЕРИНАТАЛЬНЫМИ ПОРАЖЕНИЯМИ ЦНС
© 2008 г. Н.Ю. Сотникова, Е.В. Серкина, О.А. Громова*
ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»;
*ГОУ ВПО Ивановская медицинская академия, г. Иваново, Россия
Поступила: 13.02.08 г. Принята: 25.04.08 г.
Целью работы было установить особенности внутриклеточной экспрессии мРНК МТ-1 и поверхностной Fas и FasL лимфоцитами периферической крови, сывороточного уровня GFAP у доношенных новорожденных с перинатальными гипокси-чески-ишемическими поражениями ЦНС и влияние на эти параметры препарата «Церебролизин» (фирма EBV, Австрия). Было установлено, что у новорожденных с перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС в периферической крови был снижен уровень лимфоцитов, экспрессирующих Fas, но повышено содержание FasL-позитивных клеток по сравнению с показателями детей контрольной группы. После лечения препаратом «Церебролизин» у детей с ПП ЦНС в периферической крови нормализовалось содержание Fas- и FasL-позитив-ных лимфоцитов. У новорожденных с перинатальными поражениями ЦНС уровень GFAP в периферической циркуляции практически не отличался от параметров детей контрольной группы, но он повышался после лечения препаратом «Це-ребролизин». Уровень экспрессии мРНК МТ-1 периферическими лимфоцитами детей с перинатальными поражениями ЦНС был ниже, чем у здоровых детей, однако он повышался выше нормы после лечения препаратом «Церебролизин». Можно предположить, что «Церебролизин» нормализует параметры апоптоза, оказывает нейропротективный эффект, восстанавливает кровоток в пораженных участках мозга, за счет чего снимается отек, и повышается уровень GFAP и МТ-1.
Ключевые слова: апоптоз, периферическая кровь, лимфоциты, глиофибрилляр-ный кислый протеин, металотионеин-1
ВВЕДЕНИЕ
Между нервной, эндокринной и иммунной системами существуют множественные связи, которые обеспечивают физиологическую иммунорегуляцию [1]. Нарушение этого взаимодействия ведет к развитию ряда заболеваний [1]. Особенно актуальной проблема изучения взаимосвязи между нервной и иммунной системами является для новорожденных в условиях постнатальной адаптации, поскольку перинатальные поражения ЦНС (ПП ЦНС) занимают одно из ведущих мест в стру-
Адрес: 153003, г. Иваново, ул. Красных Зорь, д. 14, кв. 63. E-mail:niimid.immune@mail.ru
ктуре заболеваемости новорожденных [2]. Более того, они являются частой причиной детской инвалидности [2]. При этом заболевания нервной системы, приводящие к инвали-дизации и дезадаптации детей, в 70 — 80% случаев обусловлены воздействием перинатальных повреждающих факторов [3].
Существует большое количество факторов, влияющих на возникновение перинатальных поражений центральной нервной системы, включая неблагоприятную экологическую обстановку (ионизирующее излучение, токсические воздействия, в том числе при применении различных лекарственных веществ, загрязнение окружающей среды солями тяжелых металлов и промышленными отходами и пр.), осложнения беременности и т.д. Одна-
ко одним из ведущих антенатальных факторов, вызывающих перинатальные поражения ЦНС плода, является фетоплацентарная недостаточность [4].
Согласно современным представлениям, в основе гипоксической энцефалопатии лежат метаболические расстройства (метаболическая катастрофа), приводящие к запуску каскада патологических процессов, развитие которых в течение определенного промежутка времени может приводить с одной стороны, к гибели нервных клеток путем апоптоза, а с другой к изменениям церебрального кровотока плода [5]. Можно выделить несколько путей индукции запрограммированной гибели клетки, в конечном итоге приводящих к активации каспазы-3, ключевого эффекторного белка в каскаде апоптоза, расщеплению ядерных субстратов данным ферментом и фрагментации ДНК [6]. Один из основных путей включения апоптоза связан с так называемыми рецепторами смерти плазматической мембраны, который опосредуется специфическими взаимодействиями по типу рецептор-ли-ганд [7].
В последние годы значительное количество работ посвящено изучению нейронального апоптоза в экспериментах на животных [8, 9], однако практически отсутствуют исследования, посвященные изучению апоптоза лимфоцитов у новорожденных детей с перинатальными гипоксическими поражениями ЦНС. Недостаточно изученными также остаются эндогенные факторы, направленные на ограничение и восстановление очагов поражения нервной ткани.
Одним из наиболее хорошо зарекомендовавших себя в клинической практике для лечения поражений ЦНС является препарат «Церебролизин». «Церебролизин» обладает нейротрофической активностью, сходной с активностью фактора роста нервов, нейро-протективными свойствами, за счет анти-апоптозного действия и повышения пластичности нейронов [10]. В связи с вышеизложенным, можно предположить, что использование препарата «Церебролизин» для лечения гипоксически-ишемических поражений ЦНС у новорожденных выглядит теоретически обоснованным.
Эффективность применения «Цереброли-зина» в лечении детей с минимальной мозговой дисфункцией, последствиями закрытой черепно-мозговой травмы, ночным энурезом, гипоакузией хорошо освещена в литературе. Однако данные о применении «Церебролизи-
на» в терапии новорожденных с тяжелыми перинатальными поражениями ЦНС в остром периоде заболевания отсутствуют, а об использовании его в раннем восстановительном периоде имеются лишь единичные публикации [11].
Изучение особенностей триггерных процессов включения апоптоза, регулирующих его факторов, и влияния на них «Церебролизина» позволит уточнить механизмы формирования ПП ЦНС у новорожденных и оптимизировать методы лечения ПП ЦНС у новорожденных первого месяца жизни.
Цель работы: установить особенности внутриклеточной экспрессии мРНК МТ-1 и поверхностной Fas и FasL лимфоцитами периферической крови, сывороточного уровня GFAP у доношенных новорожденных с перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС и влияние на эти параметры препарата «Церебролизин» (фирма EBV, Австрия).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты
Под наблюдением находилось 20 детей первого месяца жизни, 10 из которых составили основную группу и 10 практически здоровых доношенных новорожденных — контрольную группу. Основную группу составили дети с перинатальными гипоксически-ишеми-ческими поражениями ЦНС средней степени тяжести с оценкой по шкале Апгар на 1-й минуте жизни 6,83±0,4, на 5-й минуте — 8,0±0,26. Диагноз ставился на основании данных клинического обследования и результатов нейросонографии. Степень гипоксиче-ских поражений ЦНС оценивали согласно классификации перинатальных поражений нервной системы у новорожденных Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины. (Классификация перинатальных поражений нервной системы и их последствий у детей первого года жизни. Методические рекомендации. Москва, 2006, 63.) Основными клиническими проявлениями патологии ЦНС были: гипертензивный синдром у 60% детей, гипертензивно-гидроцефальный синдром у 8,6% новорожденных, синдром угнетения — у 18,6%, внутрижелудочковые кровоизлияния 1 степени — у 8,6% детей. Дети основной группы были обследованы дважды — до и сразу после лечения препаратом «Церебролизин».
«Церебролизин» назначался по следующей схеме по 0,1 мл на кг/массы тела внутримышечно через день, на курс всего 10 инъекций.
Материалом для исследования служила периферическая кровь из локтевой вены.
Получение сыворотки периферической крови
Для исследования сывороточного содержания различных биологических продуктов кровь в количестве 1 мл отбирали в сухую центрифужную пробирку, оставляли на 10—15 мин до полного свертывания, сгусток крови осторожно обводили по стенке пробирки длинной иглой и центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин. Отделившуюся от сгустка сыворотку аликвотами по 200 мкл разливали в пробирки типа Эппен-дорф и хранили до проведения исследования в холодильнике при —20 °С. При необходимости сыворотки хранили при —80 °С и в дальнейшем использовали для оценки уровня GFAP.
Выделение мононуклеарных клеток
Для исследований методом проточной ци-тометрии, полимеразной цепной реакции в реальном масштабе времени (RT-PCR) кровь забирали в центрифужные пробирки, содержащие 2,7% раствор ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора ЭДТА. Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови осуществляли традиционным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-уро-графина (р = 1,078) (74).
Жизнеспособность мононуклеарных клеток, определяемая по окрашиванию трипано-вым синим, составляла не менее 95%. По данным световой микроскопии кольцо клеток в интерфазе Среда 199 — фиколл-урографин содержало 25 — 35% лимфоцитов и 60 — 70% макрофагов. Выход клеток в индивидуальных образцах варьировал от 0,1 до 0,25 • 106 кл/г ткани.
Проточная цитофлюориметрия
Для проточной цитометрии использовали общую фракцию мононуклеарных клеток. Количество клеток, экспрессирующих Fas и FasL, определяли с помощью моноклональ-ных антител (мАТ) методом проточной ци-тофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюо-рохромных меток использовали флюорес-
Таблица 1. Характеристика моноклональных антител, использованных в работе
МАТ Клон Фирма-производи- Флюо-
тель рохром
CD95 DX2 CALTAG Laboratories, PE
(Fas/APO-1) США
CD45 ICO-46 НПЦ FITC
«МедБиоСпектр»,
Россия
CD14 ICO-174 НПЦ PE
«МедБиоСпектр»,
Россия
CD95L, FasL AIf-2.1 CALTAG Laboratories, PE
США
Мышиные - Becton Dickinson, FIFC
IgG1 США
Мышиные - Becton Dickinson, PE
IgG2a США
цеин изотиоционат (FITC) и фикоэрит-рин (РЕ).
Фирма-производитель и клон используемых в исследовании мАТ указаны в таблице 1.
Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. При проведении проточной цито-ме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.