ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 527-532
ВЛИЯНИЕ УГЛЕВОДНОГО СОСТАВА ЦИТОЗОЛЯ КОНИДИЙ Aspergillus niger НА ИХ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ
© 2004 г. В. М. Терёшина, Ä. В. Ковтуненко, Ä. С. Меморская, Е. П. Феофилова
Институт микробиологии РАН, Москва, 117312 e-mail: V.M.Tereshina@mail.ru feofilov@inmi.host.ru Поступила в редакцию 2004 г.
Установлено, что на жизнеспособность конидий Aspergillus niger в процессе хранения отрицательно влияли интенсивность спорогенеза, появление в их составе низкомолекулярных полиолов и глюкозы, активация синтеза углеводов. Напротив, сохранению всхожести конидий способствовало преобладание в исходном составе углеводов трегалозы над маннитом и отсутствие глицерина, эритрита и глюкозы. Обсуждается значение полученных данных в связи с биохимическими критериями, которые могут быть использованы для характеристики состояния покоя у грибов и сохранения всхожести посевного материала.
Растворимые углеводы цитозоля грибов (тре-галоза и полиолы) являются не только запасными веществами, но также протекторами мембран и белков при обезвоживании и термострессе [1-3]. Полагают, что эти протекторные углеводы, называемые "химическими шаперонами", взаимодействуют с молекулярными шаперонами, например с белками теплового шока (БТШ), образуя единую систему защиты макромолекул клетки в период температурного стресса [4]. Эти соединения, в большом количестве (до 20%) накапливающиеся в спорах грибов, могут влиять на сохранение их жизнеспособности и прорастание. Так, например, полученные нами ранее данные на примере мутантных штаммов Cunninghamella japonica с пониженной способностью к спорообразованию выявили прямую корреляцию между количеством трегалозы в спорах и их способностью к прорастанию [5, 6].
Известно, что состав углеводов спор зависит от многих факторов - состава среды, освещения, температуры, осмотического давления. Например, установлено, что споры Metarhizium anisopliae, полученные на среде с 14% глицерина, содержали высокое количество глицерина и эритрита и прорастали на средах с низкой влажностью [7]. Освещение грибов рода Aspergillus зеленым светом приводило к стимуляции спорогенеза [8] и увеличению уровня глюкозы в конидиях A. japonicus [9]. Такие споры быстрее прорастали, но хуже хранились.
Конидии A. niger используют в качестве посевного материала в промышленных производствах, например при получении лимонной кислоты, поэтому особое значение приобретает проблема хранения активного посевного материала, что оп-
ределяет практическую ценность данного исследования.
Цель работы - получение конидий с различным составом углеводов, используя различные питательные среды, воздействие супраоптималь-ной температуры, освещение зеленым светом, изменение осмотического давления среды, а также исследование взаимосвязи между составом углеводов цитозоля конидий и их жизнеспособностью в процессе хранения.
МЕТОДИКА
Основным объектом исследования служил ми-целиальный гриб Aspergillus niger (штамм ИНМИ РАН), который выращивали на косяках с сусло-агаром в течение 5-6 сут при 30-32°С в темноте и хранили при комнатной температуре, пересевая 1 раз в два месяца.
Для получения конидий с различным составом углеводов использовали среды, отличающиеся источниками углерода и азота: сусло-агар, агари-зованная среда Чапека и Блюменталя-Роземана. Для выяснения влияния различных протекторных сахаров на состав углеводов конидий использовали среду Чапека, в которой сахарозу частично замещали на другие сахара. В результате было получено 8 вариантов конидий, которые выращивали в течение 10 сут. Вариант 1: сусло-агар (7°Б), при 30-32°С, в темноте; вариант 2: то же, но выращивание при 36-37°С; вариант 3: то же что и вариант 1, но с облучением зеленым светом (фотопериод 16 ч с момента посева) с интенсивностью 1.7 Вт/см2, используя люминесцентную лампу К-35 (^max = 525 нм); вариант 4: агаризованная среда Чапека (г/л): сахароза - 30, KH2PO4 - 1,
Таблица 1. Интенсивность спорогенеза А. ш§ег в зависимости от условий
№ среды Среда Условия Количество конидий, 106/см2
1 Сусло-агар Темнота, 30-32°С 34.0
2 » Темнота, 36-37°С 10.1
3 » Зеленый свет, 30-32°С 127.8
4 Среда Чапека Темнота, 30-32°С 5.6
5 », с 2% трегалозы » 6.8
6 », с 2% маннита » 6.1
7 », с 2% глицерина » 6.3
8 », с 14% глицерина » 7.5
М§Б04 - 0.5, №N03 - 2, КС1 - 0.5, Бе804 - 0.01; выращивание в темноте при 30-32°С; вариант 5: то же, что и (4), но сахароза на 2/3 заменена на тре-галозу; вариант 6: на маннит; вариант 7: на глицерин; вариант 8: то же, что и (4), но вместо сахарозы - 14% глицерина. Кроме того, конидии получали на агаризованной среде Блюменталя-Роземана [10], в состав которой входят (г/л): сахароза - 30 , КН2Р04 - 10 , М§Б04 - 10 , ^Н4)28 04 -10, КС1 - 0.05, микроэлементы: Бе804 - 0.01, 2и804 - 0.05.
Сбор конидий с поверхности агаровой среды осуществляли безводным методом с помощью углеводорода додекана [11]. Конидии хранили по заводской методике, в стеклянных пробирках с ватными пробками при комнатной температуре (18-22°С) и влажности.
Для определения жизнеспособности конидий А. niger использовали разработанный нами экспресс-метод [12]. Для подсчета проросших конидий использовали световой микроскоп "1еиауа1" (Германия) и окулярную сетку, которую помещали на поверхность твердой среды. Проросшими считали конидии с ростковой трубкой, большей половины их диаметра. Подсчет проводили в 610 квадратах (около 600 клеток).
Определение состава растворимых углеводов цитозоля конидий А. niger проводили, как описано ранее [12].
Для определения количества гликогена споры 3-4-кратно разрушали методом замораживания -оттаивания и растиранием в ступке с кварцевым песком, контролируя степень разрушения под световым микроскопом. Гликоген экстрагировали кипящей водой в течение 20 мин 4-кратно. В полученном экстракте проводили ферментативный гидролиз, используя амилоглюкозидазу [13]. Для ана-
лиза образующейся глюкозы использовали глюко-зооксидазный метод [14].
Статистическую обработку результатов проводили по критерию знаков и с использованием медианы при п = 3-4 [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование образования конидий на средах различного состава показало, что более интенсивное их образование происходило на сусло-агаровой среде, богатой сахарами, витаминами и аминокислотами. Для сравнения на среде Чапека с нитратным азотом - в 5-6 раз меньше (табл. 1). На среде Блюменталя-Роземана, содержащей аммонийный азот, образование конидий сильно ин-гибировалось, что согласуется с данными литературы о подавлении спорогенеза аммонийным азотом и стимуляции нитратами, аминокислотами и органическими кислотами [16].
Частичная замена в среде Чапека сахарозы на протекторные углеводы - трегалозу, маннит и глицерин - не оказывало существенного влияния на спорогенез. Повышение температуры культивирования на 4°С снижало количество конидий на сусло-агаре в 3 раза, а освещение поверхностной культуры зеленым светом в 4 раза увеличивало. Таким образом, показано, что существенное увеличение количества конидий можно получить только при фотоспорогенезе.
Количество растворимых углеводов в исходных конидиях А. niger зависело от состава среды и было выше на всех вариантах среды Чапека (817%), чем на сусло-агаре (3-4% углеводов от сухой массы) (табл. 2). Изучение состава углеводов цитозоля конидий показало, что растворимые углеводы представлены, в основном, трегалозой и маннитом, а также минорными сахарами - глицерином, эритритом и арабитом, полисахарид гликоген отсутствовал.
Изучали изменение состава углеводов конидий в зависимости от условий их получения. Установлено, что в двух случаях - при введении трегало-зы в состав среды и выращивании в супраопти-мальных температурных условиях количество трегалозы в конидиях возрастало в 2-3 раза, внесение глицерина (14%) создавало осмотическое давление в среде и приводило к появлению в составе углеводов конидий глицерина и эритрита; в двух случаях - при освещении зеленым светом и на среде с высоким количеством глицерина в составе углеводов конидий наблюдалось одинаковое содержание трегалозы и маннита, тогда как во всех остальных вариантах трегалоза существенно преобладала над маннитом. Таким образом, использование различных условий выращивания позволило получить конидии с различным составом углеводов.
ВЛИЯНИЕ УГЛЕВОДНОГО СОСТАВА ЦИТОЗОЛЯ КОНИДИИ 529
Таблица 2. Состав углеводов цитозоля и всхожесть исходных конидий, полученных в различных условиях
Вариант
Всхожесть,
Углевод, % от сухой массы
конидий % глицерин эритрит арабит маннит трегалоза Сумма
1 88.1 - - 0.1 1.1 1.8 3.0
2 88.3 - - - 0.6 3.7 4.3
3 88.0 - - 0.2 1.3 1.5 3.0
4 80.1 - - 0.1 3.6 5.0 8.7
5 81.3 - - 0.1 5.6 9.0 14.7
6 81.0 - - 0.6 4.5 5.1 10.2
7 81.6 - - 0.5 5.4 6.7 12.6
8 82.0 1.0 0.4 2.1 6.7 6.5 15.7
Исследование зависимости между всхожестью конидий, условиями их получения и длительностью хранения показало, что исходная способность к прорастанию (всхожесть) была на 6-8% выше у конидий, полученных на средах с суслом, по сравнению с конидиями, полученными на среде Чапека (табл. 2).
Изучение изменения всхожести и количества углеводов при хранении конидий выявило общую закономерность - в процессе хранения наблюдались значительные (в 2-4 раза) колебания уровня растворимых сахаров независимо от условий выращивания (рис. 1). Так, в конидиях, выращенных на сусло-агаре и содержащих мало углеводов, наблюдался рост уровня сахаров в течение 130 сут, после чего он начинал снижаться. В вариантах конидий, полученных на среде Чапека с модификациями, исходное высокое количество углеводов резко снижалось к 50 сут хранения, а затем начинало вновь увеличиваться, достигая к 210 сут практически исходного уровня. Интересно отме-
% от сухой массы 25
20 15 10 5
0 30 60 90 120 150 180 210
сут
Рис. 1. Изменения общего количества растворимых сахаров в процессе хранения различных вариантов конидий. 1-8 - варианты сред.
тить, что в варианте опыта, в котором конидии были получены при супраоптимальной температуре, наблюдались самые резкие колеба
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.