БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 941-945
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.3+578.61
ВЛИЯНИЕ УРИДИНА НА ВЫНОСЛИВОСТЬ ЖИВОТНЫХ С РАЗНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКЕ: Р ОЛЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО АТФ-ЗАВИСИМОГО
КАЛИЕВОГО КАНАЛА
© 2014 г. И.Н. Маньковская*, В.И. Носарь*, О.С. Горбачева** ***, О.А. Гончар* Б.Л. Гавенаускас*, Л.В. Братусь*, Г.Д. Миронова** ***
*Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, 01024, Киев, ул. Богомольца, 4;
**Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3;
***Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, пр. Науки, 3 *E-mail: mironova40@mail.ru Поступила в p едакцию 19.06.14 г.
Исследована способность уридина - метаболического предшественника уридиндифосфата, природного активатора митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала (митоКАтф-канала) - влиять на выносливость организма к физическим нагрузкам. Выносливость определяли путем р егистрации времени, в течение которого крысы плавали до изнеможения при t = 32°С с 20% от массы тела грузом. Было установлено, что высоковыносливые животные плавали до изнеможения в среднем 7,40 ± 0,35 мин, тогда как время плавания низкоустойчивых крыс было равно 2,07 ± 0,10 мин. Введение животным уридина по-р азному влияло на время плавания, увеличивая его в два раза у низкоустойчивых крыс. Эффект уридина снимался ингибиторами митоКАтф-канала. Показано, что введение низкоустойчивым крысам уридина увеличивало скорость транспорта калия в изолированных из этих крыс митохондриях, а ингибиторы канала предотвращали активирующее канал действие уридина. Обсуждается вопрос о роли митоКАтф-канала в формировании устойчивости организма к физической работе и защите от гипоксии.
Ключевые слова: митохондрии, митохондриальный А ТФ-зависимый калиевый канал, уридин, гипоксия.
П роблема выносливости организма к физической нагрузке тесно связана с адаптацией животного к гипоксии, которая развивается при этих нагрузках. Ее решение необходимо для разработки методов защиты ор ганизма не только в нормальных условиях, но и в условиях стресса, особенно окислительного, а также для лечения многих заболеваний, особенно сердечно-сосудистых. Это побудило многих исследователей заняться поиском природных и синтезированных лекарственных препаратов, предупреждающих р азвитие окислительного стресса.
Относительно недавно было обнаружено участие митохондриального АТФ-зависимого
Сокращения: митоКАТФ-канал - митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал, УДФ - уридиндифосфат, 5-ГД -5-гидроксидеканоат, ГЛ - глибенкламид.
калиевого канала (митоКАТФ-канала) в карди-опротекции и адаптации организма к гипоксии [1-4]. Нами было показано, что введение животным метаболических предшественников природного активатора митоКАТФ-канала уридиндифосфата (УДФ) - уридина и ур идинмонофос-фата перед моделированием ишемии миокарда, защищает сердце от ишемических повреждений, восстанавливая р итм сердца и уменьшая зону инфаркта, а также предупреждая изменения энергетического и окислительного обменов в поврежденном миокарде [5-7].
Целью нашей работы было выяснить способность уридина влиять на выносливость организма к физическим нагрузкам, а также установить, опосредовано ли его влияние модуляцией активности митоКАТФ-канала.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Метод исследования выносливости крыс к физической нагрузке. Выносливость к физической нагрузке определяли путем регистрации времени, в течение которого кр ысы-самцы линии Вистар плавали с 20% от массы тела грузом при г = 32°С до изнеможения (залегание на дно бассейна в течение 15 с). Уридин и ингибиторы митоК АТФ-канала - 5-гидроксидеканоат (5-ГД) и глибенкламид (ГЛ) - вводили внутри-брюшинно. Для работы были использованы самцы крыс линии массой 250-300 г.
Все процедуры, пр оводимые с животными, со -ответствуют требованиям Декларации Совета Европейского Союза 86/609/ЕЕС.
Метод выделения митохондрий. Животных декапитировали под легким эфирным нар козом, печень помещали в охлажденную среду выделения (70 мМ сахарозы, 210 мМ Д-маннитола, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ ЫЕРЕБ, рН 7,2). Затем печень измельчали и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 8-кратном объеме среды выделения относительно массы ткани. Для выделения митохондрий гомогенат центрифугировали 7 мин при 700 g (4°С), затем супернатант центрифугиро-вали 15 мин при 11000 g (4°С). Осадок, содержащий митохондрии, суспендировали в небольшом объеме среды без добавления ЭДТА и хранили при 4°С.
Метод определения скорости транспорта калия в митохондриях и его количества в них.
Транспорт калия определяли спектрофотомет-рически по светопоглощению пр епа рата митохондрий при 520 нм, отражающем величину набухания митохондрий вследствие накопления в них калия и воды [8]. Ср еда инкубации митохондрий содержала: 50 мМ КС1; 5 мМ Ка2ЫР04; 0,5 мМ MgC12; 0,1 мМ ЭГТА; 5 мкМ цитохрома с, 5 мМ ЫЕРЕБ; рЫ 7,2. Концентрация митохондриального белка в кювете со -ставляла 0,2 мг/мл. Набухание митохондрий инициировали внесением 5 мМ сукцината в присутствии 2 мкМ ротенона.
АТФ-зависимый выход калия из митохондрий, индуцированный 50 мкМ разобщителя 2.4-динитрофенола, также отражающий работу митоКАТф-канала, но в обр атном направлении [9], измеряли с помощью калий-селективного электрода в ячейке объемом 1 мл при постоянном перемешивании при г = 26°С. Среда инкубации содержала: 170 мМ сахарозы; 80 мМ Д-маннитола; 5 мМ Ка2ЫР04; 10 мМ трис-ЫС1 (рЫ 7,2); 1 мкг/мл олигомицина; концентрация митохондриального белка в кювете составляла
0,9-1,1 мг/мл. Скорость выхода калия из митохондрий рассчитывали по количеству вышедших из митохондрий в ср еду ионов в мин/мг белка.
Определение количества калия в митохондриях пр оводили с помощью селективного калиевого электрода в ячейке объемом 1 мл при постоянном перемешивании при г = 26°С. Среда инкубации содержала: 170 мМ сахарозы; 80 мМ Д-маннитола; 5 мМ Ка2ЫР04; 10 мМ трис-ЫС1 (рЫ 7,2); концентрация митохондриального белка в кювете составляла 0,9-1,1 мг/мл. В ср еду с митохондриями добавляли детергент (0,05% тритон Х-100). Количество калия ра ссчитывали по количеству ионов, появляющихся в среде инкубации после разрушения митохондрий добавленным тритоном Х-100.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В работе установлено, что исследованные крысы по-р азному реагировали на предъявленную нагрузку. Животные плавали в среднем от 7,5 до 2 мин. В экспериментальные группы были включены только высоковыносливые к физической нагрузке животные, которые плавали до изнеможения в ср еднем 7,40 ± 0,35 мин, и низковыносливые животные, время плавания которых до изнеможения было равно - 2,07 ± 0,10 мин. Влияние уридина на время плавания животных с нагрузкой исследовалось только на высоковыносливых и быстро утомляемых низковыносливых животных.
Уридин является метаболическим предшественником природного активатора мито-Катф УДФ. Он обладает низкой токсичностью и способностью, в отличие от уридиндифосфа-та, проходить через биологические мембраны, образуя в клетке уридинди- и уридинтрифосфат [10]. Из уридина в тканях образуются уридин-дифосфат, активатор митоКАТФ-канала [11], и уридинтрифосфат, из которого в клетке образуется активирующая ресинтез гликогена УДФ -глюкоза [10]. Эти два свойства уридина мы учитывали при обсуждении р езультатов работы.
Установлено, что при внутрибрюшинном введении крысам уридина (30 мг/кг) за 60 мин до плавания у исследуемых животных наблюдались изменения во времени их плавания до изнеможения (табл. 1). Как видно из таблицы, у низковыносливых крыс это время увеличивалось значительно, в среднем вдвое (с 2,07 ± 0,10 мин до 4,28 ± 0,25 мин, п = 9). В то же время, высоковыносливые животные, которые плавали значительно дольше, при введении ури-дина снижали время своего плавания, котор ое
Таблица 1. Время плавания крыс до изнеможения
Условия эксперимента Время, мин
Высоковыно сливые крысы Низковыносливые крысы
Плавание, п = 8 7,40 ± 0,35 2,07 ± 0,10
Уридин+ плавание, п = 8 4,11 ± 0,18* 4,28 ± 0,25*
5-ГД+ плавание, п = 7 3,26 ± 0,25* 1,08 ± 0,34*
5-ГД+уридин+ плавание, п = 6 2,35 ± 0,45* 2,15 ± 0,24*
ГЛ+ плавание, п = 5 3,36 ± 0,45* 1,10 ± 0,14*
ГЛ+уридин+ плавание, п = 5 2,30 ± 0,25* 1,57 ± 0,41*
Примечание: 5-ГД - гидроксидеканоат; ГЛ - глибенкламид. * Отличия статистически достоверны по сравнению с контролем (P < 0,05)
достигло величины, равной той, что наблюдалась у низковыносливых животных в присутствии уридина (4,11 ± 0,18 мин). Таким образом, в присутствии уридина оба типа животных плавают до изнеможения примерно одинаковое количество времени.
Снижение под влиянием уридина времени плавания высоковыносливых животных мы связываем со способностью уридина усиливать синтез гликогена, метаболизм которого различается у исследуемых типов животных [12]. Мы полагаем, что введение уридина крысам с повышенной работоспособностью, у котор ых исходно повышен этот синтез, приводит к увеличению синтеза гликогена в миокарде этих животных выше критического уровня. Вполне вероятно, что у ослабленных животных этот синтез снижен, а под влиянием ур идина он несколько усиливается, в результате накопления уридинтрифосфата, что вносит свой вклад в развитие выносливости. Следует отметить, что накопление гликогена выше нормы приводит к повышению гликолиза и накоплению молочной кислоты [12], которая может снижать работоспособность этих животных. Вполне возможно, что у высоковыносливых животных введение ур идина создает со стояние «химической перетренир овки». Однако это утвер ждение нуждается в экспериментальном подтверждении.
Для того, чтобы выяснить, в какой степени время возможного плавания животных зависит от работы митоКдТф-канала, мы использовали ингибиторы канала (5-ГД и ГЛ) и показали, что они достоверно снижают время плавания животного. Однако их эффект также зависит от физического состояния животных. Как видно из табл. 1, 5-ГД и ГЛ значительно снижают время плавания низковыносливых крыс (до 1,08 ± 0,34 и 1,10 ± 0,14 мин соответственно), но их эффект у
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.