научная статья по теме ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ АДСОРБЦИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ НА АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ АДСОРБЦИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ НА АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 5, с. 557-563

УДК 612.577.11

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ АДСОРБЦИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ НА АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ

© 2012 г. Ю. Н. Тараканова*, Д. А. Дмитриев*, Ю. С. Массино*, М. Б. Смирнова**, О. Л. Сегал**, О. В. Фартушная*, Д. А. Яковлева*, Г. И. Коляскина***, В. Ф. Лавров*, А. Д. Дмитриев*

*Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, 105064 ** Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва *** Научный центр психического здоровья РАМН, Москва е-mail: add0547@yandex.ru Поступила в редакцию 28.11.2011 г.

Исследована антигенсвязывающая активность иммобилизованных антител в зависимости от рН насыщающего буфера. Проанализировано 28 моноклональных антител (МКА), секретированных различными гибридомами к трем вирусным антигенам: ядерный белок p23 вируса гепатита С (С core-protein p23), белок р24 ВИЧ 1 и поверхностный антиген вируса гепатита B (HBsAg). Антитела адсорбировали на поверхности иммунных планшетов в кислом (рН 2.8), нейтральном (рН 7.5) и щелочном (рН 9.5) буферах. Проведено тестирование связывания меченых антигенов (биотинилиро-ванные или конъюгированные с пероксидазой хрена) с иммобилизованными антителами. Показано, что 10 из 28 (36%) проанализированных МКА значительно лучше сохраняли антигенсвязываю-щую активность, если процесс их пассивной адсорбции на поверхности полистироловых планшетов происходил в кислом буфере (рН 2.8). Этот подход позволил сконструировать высокочувствительный сэндвич-метод определения HBsAg с минимальной, достоверно определяемой концентрацией антигена — 0.013—0.017 нг/мл. Описанный прием может быть рекомендован для оптимизации сэндвич-методов и твердофазных конкурентных методов.

Биологическая активность сорбированных антител является важнейшим фактором, определяющим эффективность твердофазных конкурентных и сэндвич-методов тестирования антигенов. В упомянутых методах пассивная адсорбция является наиболее распространенным способом иммобилизации антител на поверхность твердой фазы, что обусловлено ее простотой и дешевизной [1—5]. Вместе с тем адсорбция на поверхности пластиковых иммунных планшетов вызывает значительное уменьшение антигенсвязывающей активности МКА. Показано, что после адсорбции биологическую активность утрачивают от 75 до 99% МКА [6, 7]. К числу наиболее существенных факторов, влияющих на сохранение биологической активности антител, относятся состав и физико-химические свойства буферных систем, используемых в процессе сорбции [5]. Имеется большое число работ, посвященных анализу влияния рН на адсорбцию разнообразных антигенов (вирусные белки, липополисахариды и др.) на поверхности иммунных пластиковых планшетов в твердофазных вариантах иммуноферментного анализа (ИФА) [8—10]. Однако, как ни парадоксально, вопрос воздействия рН на биологическую активность сорбированных антител в литературе освещен весьма скудно. Традиционно полагают, что оптимальными буферными системами для адсорбции антител на полистироловую поверхность

являются фосфатный (рН 7.0—7.5) и карбонатный (рН 9.0—9.6) буферы [5]. Вместе с тем в некоторых более ранних работах описаны поликло-нальные и моноклональные антитела, требующие для сохранения своей биологической активности использования буферов с низким значением рН [11, 12]. Так, в работе французских авторов [11] наблюдали увеличение активности поликлональ-ных козьих антител (обнаружено по возрастанию сигнала в ИФА) после их сорбции на полистироловые планшеты при рН 5.0 (по сравнению с рН 7.5). Кроме того, согласно неопубликованным в реферируемых журналах, но известным среди специалистов техническим заметкам [12], встречаются такие МКА, которые дают лучшие результаты при конструировании сэндвич-методов после их адсорбции на полистироловую поверхность при рН 3.0. Однако в указанной работе [12] не было представлено подробного анализа анти-генсвязывающей активности МКА после их адсорбции при разных значениях рН.

Цель работы — анализ биологической активности 28 МКА после их сорбции при различных значениях рН: в щелочном (рН 9.5), нейтральном (рН 7.5) и кислом (рН 2.8) буферах.

МЕТОДИКА

В исследовании использовали 96-луночные полистироловые планшеты "MaxiSorp" фирмы "Nunc" (Дания), стрептавидин-пероксидазу фирмы "Biosource" (США) и LC-LC-биотин фирмы "Pearce" (США). Прочие реактивы были произведены фирмой "Sigma" (США). Рекомбинант-ные белки р24 ВИЧ1 (генотип 1а) [13] и соге-бе-лок р23 вируса гепатита С (генотип 1b) [14] были экспрессированны в Escherichia coli. Поверхностный антиген вируса гепатита В (HВsAg) серотипа ayw (S-полипептид) [14] был экспрессирован в Pi-chiapastoris. Рекомбинантные белки произведены НПО "Диагностические системы" (Россия).

Получение моноклональных антител к рекомби-нантным белкам. Гибридомы, секретирующие МКА к рекомбинантным белкам, получали, как описано ранее [15, 16]. Отбирали гибридомы, антитела которых давали окрашивание в ИФА при связывании с иммобилизованным антигеном при разведении культуральных супернатантов в (2—3) х 104 раз. Положительные гибридомы клонировали не менее трех раз. МКА очищали из асцитной жидкости до чистоты более 95% с помощью хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе, как было описано ранее [16, 17].

Биотинилирование рекомбинантных белков и моноклональных антител. Белки р24, р23 и МКА 18С8 биотинилировали в соответствии с рекомендациями фирмы "Pearce" (США). С этой целью белок р24 ВИЧ 1 и МКА растворяли в 0.1 М гидрокарбонате Na. Соге-белок вируса гепатита С (р23) растворяли в том же буфере с 0.5% лау-рилсаркозила и биотинилировали 2 ч в ледяной бане. Молярное отношение LC-LC-биотина (2 мг/мл в диметилсульфоксиде) и белка в инкубационной смеси составляло 4 : 1. Биотинилиро-ванный белок отделяли от свободного лиганда путем хроматографии на сефадексе G-25.

Получение конъюгата HBsAg с пероксидазой хрена. HBsAg (S-полипептид серотипа ayw) конъ-югировали с пероксидазой хрена методом Накане [18]. Молярное отношение антигена и пероксида-зы при ковалентном связывании составляло 1 : 1.

Определение антигенсвязывающей активности иммобилизованных антител. МКА адсорбировали на поверхности 96-луночных полистироловых планшетов "MaxiSorp" (3 мкг/мл, 100 мкл на лунку, ночь при комнатной температуре) в следующих буферах: 0.1 М глицин-НС1-буфер, рН 2.8; 0.025 М Na-фосфатный буфер, рН 7.5, и 0.05 М Na-гидрокарбонатный буфер, рН 9.5. Насыщенные антителами планшеты инкубировали (120 мин, 37°) с серийными разведениями меченых антигенов (1, 2,..., 64 нг/мл). Антигены разводили в 0.025 М Na-фосфатном буфере (рН 7.5), содержащем 0.15 М NaCl, 0.2% БСА и 0.05% тви-на 20 (ELI-буфер). После отмывки в лунки добавляли стрептавидин-пероксидазу (50 нг/мл), растворенную в ELI-буфере, содержащем 1% казеина вместо БСА. После инкубации (30 мин, 37°) и

отмывки иммунные комплексы окрашивали тет-раметилбензидином (ТМБ). Окрашивание регистрировали на плашечном сканере при длине волны 450 нм.

Определение относительного количества антител, иммобилизованных на поверхности 96-луноч-ных полистироловых планшетов при кислых, нейтральных и щелочных значениях рН сорбции. Первый подход: биотинилированные антитела клона 18С8 адсорбировали на поверхности полистироловых планшетов в кислом, нейтральном и щелочном буферах, как описано выше. После отмывки планшеты инкубировали со стрептави-дин-пероксидазой, растворенной в ELI-буфере с казеином в концентрациях 0, 0.5,..., 16 нг/мл. Комплексы биотинилированных антител и стрептавидин-пероксидазы окрашивали, как описано выше. Второй подход: антитела клона 18С8 сорбировали, как описано выше. После отмывки планшеты инкубировали с антимышиными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена в концентрациях: 0, 1.25, 2.5,., 40 нг/мл. Комплексы антител с антимышиным конъюга-том окрашивали, как описано выше.

Сэндвич-метод тестирования HBsAg. Полистироловые планшеты насыщали при комнатной температуре в течение ночи антителами клона 18С8, растворенными в 0.1 М глицин-НС1-буфе-ре, рН 2.8, или в 0.025 М ^-фосфатном буфере, рН 7.5 (3 мкг/мл, 100 мкл на лунку). Инкубационная смесь (конечный объем 200 мкл) включала 150 мкл стандарта (разведенного в сыворотке крови, заведомо не содержащей НВ8А§) и 50 мкл раствора детектирующих антител: конъюгат МКА F4F3 с пероксидазой хрена в ELI-БСА буфере (1.5 мкг/мл). Планшеты инкубировали 2 ч при 42°С и после серии отмывок выявляли иммунные комплексы, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Мы проанализировали биологическую активность иммобилизованных антител, секретиро-ванных 52 гибридомами к трем вирусным антигенам: белок р24 ВИЧ 1 — антитела 20 гибридом, соге-белок р23 вируса гепатита С — антитела 16 гибридом, НВ8А§ — антитела 16 гибридом. Очищенные антитела сорбировали на 96-луноч-ные полистироловые планшеты "Мах18огр" при рН 7.5 в концентрации 3 мкг/мл. В предварительных экспериментах для антител клонов 18С8, Р6 и С11 нами было показано, что увеличение насыщающей концентрации антител при рН 7.5 не приводило к увеличению связывания меченого антигена с сорбированными антителами. К сорбированным антителам добавляли нарастающие количества меченых антигенов: биотинилированных белков р24 ВИЧ 1 или соге-белка р23 вируса гепатита С; НВ8А§ был конъюгирован с пероксидазой хрена. Типичные кривые связывания меченого антигена с сорбированными антитела-

^450

0.9

0.6

0.3

0 10 20 30 40

нг/мл

Рис. 1. Связывание биотинилированного белка р24 ВИЧ 1 (нг/мл) с моноклональными антителами различных клонов к белку р24, адсорбированными (3 мкг/мл) на поверхность полистироловых планшетов "Мах18огр" при нейтральных значениях рН (7.5). Иммобилизованы антитела клона (приведены уравнения кривых связывания): 1 — антитела клона Р3, у = 0.054х; 2 — антитела клона Р5, у = 0.021х; 3 — антитела клона Р9, у = 0.001х.

ми к белку р24 ВИЧ 1 (для антител трех гибридом) приведены на рис. 1.

Эффективность связывания меченого антигена с иммобилизованными антителами можно охарактеризовать коэффициентом кривой связывания (то есть, тангенсом угла наклона линейного участка кривой к оси концентр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком