научная статья по теме ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА АДГЕЗИВНУЮ АКТИВНОСТЬ РОДОКОККОВ В ОТНОШЕНИИ Н-ГЕКСАДЕКАНА Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА АДГЕЗИВНУЮ АКТИВНОСТЬ РОДОКОККОВ В ОТНОШЕНИИ Н-ГЕКСАДЕКАНА»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 5, с. 501-509

УДК 579.2:579.26:579.6

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА АДГЕЗИВНУЮ АКТИВНОСТЬ РОДОКОККОВ В ОТНОШЕНИИ Н-ГЕКСАДЕКАНА

© 2012 г. Е. В. Рубцова*, М. С. Куюкина* **, И. Б. Ившина***

* Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, 614990 ** Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081, kuyukina@iegm.ru

Поступила в редакцию 18.01.2012 г.

Исследовано влияние условий роста (состав, кислотность, соленость питательной среды, температура и гидродинамический режим культивирования) на адгезию актинобактерий рода Екойососст к н-гексадекану. Проведенные исследования показали, что адгезивная активность родококков зависит от состава питательной среды и температуры их культивирования. Обсуждены возможные механизмы влияния ростовых условий на адгезию родококков к жидким углеводородам посредством изменения содержания клеточных липидов и зета-потенциала клеток. В результате исследования отобраны штаммы родококков, обладающие высокой (80—90%) адгезивной активностью при пониженной температуре (18°С), высокой солености (5.0% №С1) и кислотности (рН 6.0) питательной среды, которые могут быть перспективны для использования в биотехнологиях очистки загрязненных углеводородами почв и вод.

Известно, что в решении одной из наиболее актуальных проблем современности — загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами, ключевую роль играют углеводородокисля-ющие микроорганизмы. Поэтому микробиологические методы деструкции углеводородных соединений рассматриваются в настоящее время, как наиболее перспективные способы очистки нефтезагрязненных экосистем. В естественных условиях процессы биодеградации углеводородов часто осложняются влиянием неблагоприятных факторов, таких, как пониженная температура, высокая минерализация, экстремальные значения кислотности среды и т.д. Следует отметить, что начальным этапом процесса биотрансформации любого гидрофобного соединения является бактериальная адгезия, интенсивность которой в значительной мере зависит от физико-химических параметров среды [1]. В связи с этим исследование адгезивных свойств углеводородокисля-ющих бактерий, обладающих устойчивостью к различным экологическим факторам, представляется актуальным для развития биотехнологий очистки загрязненных нефтяными углеводородами почв и вод.

Адгезивная активность микроорганизмов определяется свойствами клеточной поверхности, прежде всего степенью ее гидрофобности [2], на которую значительное влияние оказывают условия культивирования. В зарубежной литературе встречаются исследования адгезивной активности представителей родов Bifidobacterium, Pseudomonas, Serattia [3—5]. Однако особенности адгезии актинобактерий рода Rhodococcus, активно разрабатываемых биотехнологических агентов

окислительной трансформации природных и антропогенных углеводородов, практически не изучены [6, 7]. Нами ранее [8] показана высокая адгезивная активность родококков разных видов в отношении жидких н-алканов с длиной цепи от 6 до 16 атомов углерода. При этом наибольшие показатели адгезии к исследуемым углеводородам наблюдались у представителей R. ruber, адгезивная активность которых увеличивалась с возрастанием числа углеродных атомов в молекуле н-алкана.

Цель работы — изучение влияния условий роста (состав, кислотность, соленость питательной среды, температура и гидродинамический режим культивирования) родококков на их адгезивную активность в отношении н-гексадекана.

МЕТОДИКА

Объект исследования и условия культивирования. Использовали культуры актинобактерий рода Rhodococcus, принадлежащих к видам R. erytropolis (10 штаммов), R. fascians (11 штаммов), R. longus (5 штаммов), R. opacus (6 штаммов), R. rhodochrous (4 штамма), R. ruber (6 штаммов) и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН (акроним ИЭГМ; WFCC #768; www.iegm.ru/iegmcol/index.html), а также 30 му-тантных клонов R. ruber ИЭГМ 231, полученных методом неспецифического in vitro Tn5 мутагенеза.

Для оценки влияния условий культивирования на адгезивную активность родококки параллельно выращивали на мясо-пептонном агаре

(МПА) и агаризованной минеральной среде К [9] следующего состава (г/л): КН2РО4 — 1.0, К2НРО4 — 1.0, ШС1 - 1.0, KN03 - 1.0, MgSO4 ■ 7H2O - 0.2, FeC13 ■ 7 H2O - 0.02, CaC12 ■ 2H2O - 0.02. Дополнительно в минеральную среду вносили раствор микроэлементов (1.0 мл/л) [10]; дрожжевой экстракт ("Микроген", Россия) (0.05 г/л), а также один из н-алканов: н-гексан, н-гептан, н-нонан, н-декан, н-ундекан, н-додекан, н-тетрадекан, н-гек-садекан (98%, ООО "Вектон", Санкт-Петербург) (1.0 об. %) либо глюкозу (10 г/л) в качестве источника углеродного питания. Культивирование осуществляли при 18, 28, 37°С на качалке (160 об/мин) либо стационарно в течение 3-7 сут. Также клетки выращивали в мясопептонном бульоне (МПБ) с добавлением различных (1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 10, 15 и 20%) концентраций хлорида натрия, в диапазоне pH от 4.0 до 9.0 на качалке (160 об/мин) при 28°С.

т5-мутагенез клеток родококков. Использовали транспозому EZ::TNTM (KAN-2)Tnp Transpo-someTM ("Epicentre Technologies", США), представляющую собой комплекс транспозона Tn5 с встроенным геном устойчивости к канамицину и белка транспозазы. Процедуру трансформации проводили с помощью электропоратора E. coli Pulser™ Transformation Apparatus ("Bio-Rad", США) при напряжении 2.5 кВ и емкости 10 мкФ. Частоту трансформации вычисляли по количеству выросших на чашках с LB агаром (концентрация антибиотика в среде 100 мкг/мл) устойчивых к канамицину колоний по отношению к исходному числу клеток. Возможность спонтанных мутаций оценивали путем высева клеток исходной бактериальной культуры, не подвергнутой трансформации, на чашки с агаром LB, содержащим канамицин [11].

Присутствие транспозона Tn5 в бактериальной ДНК подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров KAN-2 FP-1 (5'-АЦЦТАЦААЦАААГЦТЦТЦАТЦА-АЦЦ-3') и KAN-2 RP-1 (5'-ГЦААТГТААЦАТЦАГА-ГАТТТТГАГ-3') ("Epicentre Technologies", США). ДНК из бактериальных клеток выделяли с помощью InstaGene™ Matrix ("Bio-Rad", США), согласно протоколу компании-производителя. Амплификацию проводили в термоциклере MyCycler ("BioRad", США). В качестве положительного контроля использовали транспозон EZ::TNTM (KAN-2).

Устойчивость мутантов к канамицину оценивали дискодиффузионным методом по величине диаметра отсутствия роста вокруг индикаторных дисков ("НИЦФ", Санкт-Петербург), содержащих 30 мкг канамицина. Мутантные клоны хранили в среде LB с 10% глицерина и 100 мкг/мл канамицина при -84°С.

Определение степени адгезии клеток родококков к н-гексадекану. Адгезивную активность родо-

кокков к н-алканам (н-гексан, н-гептан, н-но-нан, н-декан, н-ундекан, н-додекан, н-тетраде-кан, н-гексадекан) (98%, ООО "Вектон", Санкт-Петербург) определяли с помощью МАТН-теста (Microbial Adhesion to Hydrocarbons — Микробная адгезия к углеводородам) по модифицированной методике, приведенной нами ранее [12]. Модификация метода заключалась в экспериментально подобранном соотношении гидрофобной-водной фаз, равном 1 : 2.5, при котором наблюдались устойчивые показатели клеточной адгезии к гидрофобному субстрату.

Для определения влияния температурных условий проведения МАТН-теста на адгезивную активность родококков к н-гексадекану показатели адгезии определяли при 18, 28 и 37°С.

Определение степени гидрофобности клеток родококков. Использовали метод солевой агрегации [13], для этого готовили различные (от 0.2 до 4M с интервалом 0.2 М) концентрации (NH4)2SO4 в 0.001 М натрий-фосфатном буфере. На предметном стекле смешивали в равных количествах раствор сульфата аммония и суспензию клеток (107 кл./мл) в физиологическом растворе. Наблюдение процесса образования клеточных агрегатов проводили через 1 мин с использованием фазово-контрастной микроскопии (Axiostar Plus, "Karl Zeiss", Германия) с масляно-иммерсионным объективом (ув. х 1000). Минимальную концентрацию раствора (NH4)2SO4, при которой наблюдалось образование клеточных агрегатов, принимали за условное значение степени гидрофобности клеток. Согласно данному методу, чем более гид-рофобна клеточная стенка бактерий, тем при меньшей концентрации раствора сульфата аммония наблюдается агрегация клеток [14]. Исходную клеточную суспензию без добавления (NH4)2SO4 использовали в качестве контроля. Фотодокументирование полученных изображений осуществляли с помощью фотокамеры "Pix-era" (США) и компьютерной программы "ВидеоТест — Размер 5.0" (Санкт-Петербург).

Определение суммарных клеточных липидов.

Суммарные клеточные липиды экстрагировали по методике [15], согласно которой 0.05 г сухой биомассы суспендировали в 1 мл дистиллированной воды с последующим добавлением 4 мл смеси хлороформ—метанол (1 : 2). Полученную смесь встряхивали и оставляли на 1 сут, центрифугировали при 2000 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливали в центрифужную пробирку, к осадку добавляли 5 мл смеси хлороформ—метанол—вода (1 : 2 : 0.8), встряхивали и центрифугировали. Супернатант объединяли с ранее полученным экстрактом и добавляли 5 мл смеси хлороформ—вода (1 : 1), повторно центрифугировали. Хлороформный слой переносили в предварительно взвешенную круглодонную колбу и упаривали на ротор-

%

100 80 60 40 20 0

II

i

1_1_I__ i I__1_1_И__1_1_И__ы

1 2 3 4 5 6

%

100 II

90 I

80

70

60

50

M

0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

Рис. 1. Адгезивная активность (%) в отношении н-гексадекана клеток родококков, выращенных на разных средах: I — МПА; II — минеральная среда в присутствии н-гексадекана; III — в присутствии глюкозы. Приведены средние данные для родококков разных видов. 1 - R. erythropolis (4), 2 - R. fascians (4), 3 -R. longus (3), 4 - R. opacus (3), 5 - R. rhodochrous (4), 6 -R. ruber (5). В скобках указано число исследованных штаммов.

ном испарителе при 60°С, после чего колбу взвешивали до достижения постоянной массы на высокоточных аналитических весах AUW 120D ("Shimadzu", Япония). Количество общ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком