ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 448-454
УДК 579.846.2.017.7.546.22
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА РОСТ, АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА СЕРЫ И КАРБОКСИЛАЗ
У Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes, ШТАММ 41
© 2004 г. М. А. Егорова*, И. А. Цаплина**, Л. М. Захарчук*, Т. И. Богданова**, Е. Н. Красильникова*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992;
e-mail: egorovamasha@yahoo.com **Институт микробиологии РАН, Москва, 117811; e-mail: tsaplina@inmi.host.ru Поступила в редакцию 11.06.2003 г.
Умеренно термофильная ацидофильная бактерия Sulfobacillus thermosulfidooxidans subsp. asporogenes, штамм 41 способна в качестве источника энергии использовать сульфиды золото-мышьякового концентрата и элементную серу. В присутствии S0 в авто- и миксотрофных условиях рост менее стабилен, чем на средах, содержащих закисное железо. В клетках сульфобацилл, выращенных на минеральной среде с 0.02% дрожжевого экстракта с добавлением серы или закисного железа и тиосульфата, обнаружены ферменты, участвующие в окислении неорганических соединений серы: тиосульфатокисляющий фермент, тетратионатгидролаза, роданаза, аденилилсульфатредуктаза, сульфитоксидаза и серадиокси-геназа. В бесклеточных экстрактах культуры, выросшей на среде с серой в авто- или миксотрофных условиях, выявлена активность ключевого фермента цикла Кальвина - рибулозобисфосфаткарбоксила-зы, а также некоторых ферментов гетеротрофной фиксации углекислоты. Активность карбоксилиру-ющих ферментов зависела от состава среды культивирования бактерии.
Аэробные ацидофильные бактерии рода Sulfobacillus относятся к группе микроорганизмов, получающих энергию при окислении восстановленных соединений серы (S2-/S0), закисного железа (Fe(II)), сульфидных минералов [1]. Оптимальные условия для роста культуры обеспечивает одновременное присутствие в среде органического вещества в малых концентрациях и указанных неорганических доноров электронов. Предполагается, что ферменты, участвующие в окислении железа, являются конститутивными [2]. Показано, что добавление тиосульфата в среду, содержащую закисное железо, приводит к интенсификации дыхания и окисления железа, увеличению поглощения углекислоты у S. acidophilus ALV [3], S. thermosulfidooxidans штаммов BC 1, 1269 [2, 3] и S. thermosulfidooxidans subsp. asporogenes 41 [4]. Последний штамм - природный аспорогенный мутант [5], и отличается от типового штамма S. thermosulfidooxidans 1269т по фенотипическим и генотипическим характеристикам [1]. У штамма 41 определены активности ферментов цикла три-карбоновых кислот, глиоксилатного шунта, путей углеводного метаболизма, а также ряда кар-боксилирующих ферментов при выращивании на средах с Fe2+ [6].
Ранее проведенные исследования выявили существенное влияние условий культивирования на рост штамма 41 и активность ряда ферментов уг-
леродного метаболизма. Показано, что активности карбоксилаз в клетках аспорогенной сульфо-бациллы значительно выше, чем у типового штамма 1269 [7]. Было установлено, что глюкоза в концентрации 0.3 мМ и более, а также дрожжевой экстракт в концентрации 0.005% тормозят ав-тотрофную ассимиляцию углекислоты у штамма 41 [4]. Активность рибулозобисфосфаткарбоксила-зы в клетках данного штамма, выросшего в миксотрофных условиях на среде с Ре(П) и дрожжевым экстрактом ниже по сравнению с активностью этого фермента у бактерий, растущих в автотрофных условиях [6]. В то же время возрастающая активность фосфоенолпируваткарбоксилазы могла компенсировать фиксацию углекислоты за счет ана-плеротического карбоксилирования и дополнительно обеспечивать клетку оксалоацетатом.
Изучение распространения штамма 41 в отвалах ряда полиметаллических месторождений Армении показало его высокое содержание как в руде, так и в рудничных водах. Предполагается, что S. thermosulfidooxidans виЬвр. asporogenes может принимать участие в окислении сульфидных минералов в природных условиях [5].
Серный метаболизм сульфобацилл изучался только у типовых штаммов S. thermosulfidooxidans 1269 и S. sibiricus N 1, в клетках которых были выявлены активности ряда ферментов, участвую-
щих в метаболизме восстановленных соединений серы [7, 25].
Цель работы - изучение влияния состава питательной среды на рост S. thermosulfidooxidans вдЬвр. asporogenes 41, активность некоторых карбокси-лаз и ферментов, участвующих в реакциях окисления неорганических соединений серы, а также оценка возможности использования штамма для выщелачивания руд и концентратов.
МЕТОДИКА
Объект исследования - аспорогенный штамм SulfobacШus thermosulfidooxidans виЬвр. asporo-genes, штамм 41 (=ИНМИ Армении В-6981), выделенный из рудничных вод отвала полиметаллического сульфидного месторождения Арманис [5]. Культуру выращивали на модифицированной среде Брайли и на среде 9К [5] в авто- и миксотроф-ных условиях. Для создания миксотрофных условий к основной среде добавляли неорганические соединения: закисное железо (70 ммоль), тиосульфат (12 ммоль) или элементную серу (0.5-1%), или золото-мышьяковый концентрат Нежданинской опытной фабрики (5%; крупность - 80%, класс -0.044 мм), и органические вещества (1.2 ммоля глюкозы и/или 0.2 г/л дрожжевого экстракта). При создании автотрофных условий в основную среду вносили закисное железо и тиосульфат или элементную серу.
Все добавляемые к основной среде субстраты стерилизовали отдельно. Кристаллическую серу и концентрат промывали дистиллированной водой и стерилизовали этанолом при б5°С до полного испарения последнего. При использовании в качестве источника энергии двухвалентного железа значение рН сред доводили до 1.6-1.8, а при наличии серы или концентрата - до 2.2-2.3.
Культивирование бактерий проводили при 48-50°С в бутылях емкостью 5 л, содержащих 4 л питательной среды, с интенсивным продуванием воздухом 1 об./об. среды в мин, а также в 250 мл колбах в статических условиях или на качалке (200 об/мин). Количество посевного материала при посеве в миксотрофные условия составляло 5-10%, а при посеве в автотрофные - 10-15% (об./об.).
Для анализа ферментов использовали культуру в экспоненциальной фазе роста. От присутствующей в среде серы освобождались фильтрованием, затем клетки собирали центрифугированием при 10000 § 30 мин, промывали сульфатным буфером (50 мМ сульфат калия, 50 мМ сульфат натрия) и значение рН доводили серной кислотой до 3.0. После этого клетки еще раз промывали 50 мМ трис-НС1 буфером, рН 7.4.
Отмытые клетки суспендировали в 50 мМ трис-ацетатном или ацетатном буфере, рН 5.06.0, для изучения ферментов серного метаболиз-
ма или 100 мМ трис-НС1 буфере, рН 7.4, при анализе карбоксилирующих ферментов. Затем их разрушали ультразвуком при 22 кГц 6 мин при 4°С. Полученный гомогенат центрифугировали при 40000 § 30 мин (4°С), супернатант использовали для определения активности ферментов.
Определение рибулозобисфосфаткарбоксила-зы (РБФ-карбоксилаза, КФ 4.1.1.39), пируваткар-боксилазы (КФ 6.4.1.1), фосфоенолпируваткар-боксилазы (ФЕП-карбоксилаза, КФ 4.1.1.31), фо-сфоенолпируваткарбокситрансфосфорилазы (ФЕП-карбокситрансфосфорилаза, КФ 4.1.1.38), фосфоенопируваткарбоксикиназы (ФЕП-карбок-сикиназа, КФ 4.1.1.32) проводили радиоизотопным методом [8]. Радиометрические измерения проводили на сцинтилляционном спектрометре ЬКБ ЯаеБе-1а 1127 (Швеция) в сцинтилляционной смеси ЖС-107. Активность ферментов оценивали по скорости фиксации радиоуглерода из 14С-бикарбоната экстрактами клеток.
Тиосульфатокисляющий фермент (тиосуль-фатдегидрогеназа, КФ 1.8.2.2.) и сульфитоксидазу (сульфит:цитохром с оксидоредуктаза, КФ 1.8.2.1.) определяли по восстановлению феррицианида при 420 нм или цитохрома с при 550 нм в присутствии тиосульфата или сульфита, соответственно [9]. АФС-редуктазу (аденозинфосфосульфатредукта-за, КФ 1.8.99.2.) измеряли по восстановлению феррицианида в присутствии сульфита и АМФ [10]. Активность роданазы (тиосульфат:цианидсульфо-трансфераза, КФ 2.8.1.1.) измеряли по образованию тиоцианата из тиосульфата и цианида [9], а активность сероокисляющего фермента (серади-оксигеназа, КФ 1.13.11.18.) - по образованию тиосульфата из серы в присутствии 2,2'-дипириди-ла и восстановленного глутатиона [11]. Тиосуль-фатредуктазу (КФ 2.8.1.3.) определяли по образованию сероводорода из тиосульфата. Сероводород улавливали фильтровальной бумагой, смоченной 60%-ным раствором КОН, и определяли с диметил-p-фенилендиамином [12]. Сера (сульфит): Бе3+ оксидоредуктазу измеряли по появлению Бе2+ в присутствии сульфита и окисного железа [13]. Активность тетратионатгидролазы измеряли по образованию тиосульфата и серы из тетратионата [14].
Реакционные смеси содержали 0.5-1.5 мг белка/мл. Активность ферментов выражали в нмо-лях субстрата/мин-мг белка.
Тетратионат, тиосульфат и элементную серу определяли методом цианолиза [15]. Сульфит измеряли колориметрически с фуксином [16]. Содержание двухвалентного железа определяли с 2,2-дипиридилом [13]. Количество железа, сульфатов и глюкозы в среде в динамике роста культуры, а также белок в бесклеточных экстрактах измеряли, как описано ранее [2, 7]. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева.
1§, кл/мл 8.0
7.6
7.2
6.8
6.4
6.0
(а)
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 ч
рН 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
1§, кл/мл 8.0
(б)
7.6 7.2 6.8 6.4 6.0
!• V ||( щ А-щ-в-. -
■
" у г
...... »-1-1—в-г ' 1 1111 1 1 1 |
2 РН; 804 , г/л
2.0 1.5 1.0
0.5 0
1§, кл/мл
ч
(в)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
РН;
глюкоза, мМ 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 ч
Рис. 1. Рост S. thermosulfidooxidans зиЬзр. asporogenes, штамм 41, в миксотрофных условиях на среде с серой и дрожжевым экстрактом: а - первый пересев, б - второй со среды, содержащей закисное железо и дрожжевой экстракт; в - на среде с серой и глюкозой; (пересев со среды, содержащей серу и дрожжевой экстракт). 1 - число клеток, ^ (кл/мл); 2 - рН; 3 - содержание глюкозы в среде, мМ; 4 - концентрация
4_
иона 8 О4 , г/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сульфобациллы способны расти, получая энергию при окислен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.