УДК 618.1450065092.9
ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОГО БЕЛКА YB-1 НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ КЛЕТКИ ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2012 г. Н. И. Моисеева1*, Т. П. Стромская1, Е. Ю. Рыбалкина1, А. В. Вайман1, М. А. Малышкина1, Е. Р. Ким2, И. А. Елисеева2, И. В. Кулаковский3, 4, Л. П. Овчинников2, А. А. Ставровская1*
Институт канцерогенеза, Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН,
115478, Москва, Каширское шоссе, 24; *электронная почта: N.I.Moiseeva@gmail.com, astavrovskaya@yahoo.com 2Институт белка РАН, 142290, Московская область, Пущино, ул. Институтская, 4 3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32 4Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 117971, Москва, ул. Губкина, 3
Поступила в редакцию 03.05.2012 г.
Многофункциональный белок УВ-1, участвующий в таких процессах, как транскрипция, сплайсинг, трансляция, рассматривается в качестве перспективного прогностического и предиктивного маркера при различных новообразованиях человека. Белок УВ-1, как показано на мезангиальных клетках почки и моноцитах, может секретироваться клетками, выполняя функции ауто- и пара-кринного митогенного фактора. Мы исследовали влияние внеклеточного УВ-1 на прирост клеток в популяции, миграцию и экспрессию генов в двух линиях клеток рака молочной железы человека (МСБ-7, ВТ-474) и в трансформированных клетках линии ЫВЬ-100. В качестве внеклеточного УВ-1 использовали рекомбинантный полноразмерный белок (гУВ-1), в котором были сохранены все функциональные сайты, необходимые для проявления различных активностей, включая связывание с рецептором МЛсЬ-З. В двух из трех клеточных популяций обнаружено увеличение прироста клеток под влиянием гУВ-1. Белок УВ-1 увеличивал скорость закрытия повреждения (раны) монослоя клеток линии МСЬ-7/га8, но не МСЬ-7 и ЫВЬ-100. Не выявлено изменения чувствительности клеток всех использованных линий к химиопрепаратам разных классов под влиянием гУВ-1. При помощи экспрессионных чипов нами изучено влияние внеклеточного и внутриклеточного УВ-1 на профиль экспрессии генов. В то время как гУВ-1, в основном, снижал количество мРНК в клетках МСЬ-7, в клетках, трансфицированных кДНК гена УБ-1, активировалась транскрипция разных групп генов. Полученные результаты показывают, что внеклеточный и внутриклеточный белок УВ-1 по-разному влияют на одни и те же культуры клеток опухолей молочной железы. Возможно, внеклеточный УВ-1 участвует в регуляции пролиферации и миграции клеток в метастатической нише.
Ключевые слова: внеклеточный белок УВ-1, биочип, рак молочной железы.
ДНК/РНК-связывающий белок YB-1 содержит эволюционно консервативный домен холо-дового шока. Белок YB-1 может находиться как в ядре, так и в цитоплазме, циркулируя между этими компартментами в зависимости от физиологического состояния клетки и внешних стимулов. В клеточном ядре YB-1 функционирует как фактор транскрипции, активируя гены, регулятор-ные районы которых содержат мотив Y-box. Его мишенями, важными для развития различных патологических процессов, служат гены MDR1, HER-2/neu, PDGF-B и др. В цитоплазме клеток YB-1 может подавлять или активировать синтез белка, а также регулировать время жизни мРНК [1].
Белок YB-1 представляет интерес в качестве маркера множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) и фактора, с которым связывают бо-
лее агрессивное течение рака молочной железы, остеосарком, рака яичников и желудка [2—6]. Белок УВ-1 ассоциирован с экспрессией таких транспортных белков семейства АВС, как, например, Р-гликопротеин и МЯР2, а также ЬЯР/МУР [7—11]. На клетках рака молочной железы показано активное участие внутриклеточного УВ-1 в эпителиально-мезенхимальном переходе клеток, играющем важную роль в инвазии и метастазировании опухолей [12].
Недавно обнаружили еще одну активность, присущую многофункциональному белку УВ-1. На модели мезангиопролиферативного нефрита крыс было показано, что этот белок секретирует-ся мезангиальными клетками и моноцитами в среду, играя роль внеклеточного митогена [13]. УВ-1 не только усиливал пролиферацию, но и
ускорял миграцию мезангиальных клеток. Оказалось, что вероятным рецептором секретируемого YB-1 является белок Notch-3 [14]. Рецепторы Notch играют важную роль в развитии организма, они участвуют в межклеточных взаимодействиях, а также вовлечены в процессы канцерогенеза и опухолевой прогрессии [15].
Группа авторов, обнаруживших активность внеклеточного YB-1 при заболеваниях почек, выдвинула гипотезу, согласно которой при нефрите внеклеточный YB-1 принимает участие в ауторе-гуляторном цикле этого белка, способствуя переходу внутриклеточного YB-1 в ядра клеток и повышая его транскрипционную активность, что приводит к активации генов PDGF-B и IFN-y, кодирующих фактор роста тромбоцитов В и интерферон у [16].
Известно, что для развития и регуляции "жизни" опухоли важны паракринные и аутокринные факторы. В представленной работе мы попытались ответить на вопрос, играет ли внеклеточный белок YB-1 роль в жизнедеятельности культивируемых клеток опухолей молочной железы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии клеток. В работе использовали клетки линий MCF-7 и BT-474 рака молочной железы человека, а также туморогенные клетки линии HBL-100 (трансформированные клетки, выделенные из грудного молока здоровой женщины). Клетки получены из коллекции Института цитологии РАН, Санкт-Петербург. Клетки культивировали в средах DMEM или RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (FSC; фирма PAA, Австрия) и инсулина (10 мкг/мл в случае клеток ВТ-474).
Выделение и очистка белка YB-1 и поли(А)-свя-зывающего белка (PABP). Рекомбинантный белок YB-1 (rYB-1) очищали как описано ранее [17]. Белок rYB-1 отличается от природного YB-1 человека заменой двух аминокислотных остатков — Q278P и D293E. Рекомбинантный PABP содержит на C-конце гистидиновую метку (His-таг). Белок PABP очищали как описано ранее [18].
Определение прироста клеток. Клетки рассева-ли в 24-луночные планшеты по 1 х 104 клеток в лунку с добавлением культуральной среды с 10% FCS. На следующий день (0 день) среду меняли на среду с 1% FCS и добавляли rYB-1 или контрольный белок. В качестве контрольного белка использовали PABP, BSA или денатурированный rYB-1 (drYB-1, полученный прогреванием rYB-1 при 70°С). Концентрация добавляемых реагентов — 50 и 500 нг/мл. Число клеток подсчитывали при помощи камеры Горяева. Клетки культивировали в течение 3 дней с ежедневным подсчетом их ко-
MCF-7/RAS
MCF-7 cl 4 cl 5
N-RASAp12
Актин
Рис. 1. Наличие белка, кодируемого мутантным геном К-ЛА^, в клонах клеток МСБ-7, трансфициро-ванных М- ЛА^Р12 (с1 4 и с1 5). Вестерн-блот.
личества. Результаты усредняли по трем экспериментам.
Определение подвижности клеток. О скорости движения клеток судили по степени зарастания раны, наносимой на клеточный монослой. В чашки Петри диаметром 35 мм рассевали по 1 х 106 клеток в 2 мл среды. Когда культура достигала плотного монослоя, среду с 10% FCS меняли на среду с 1% FCS и митомицином C (Sigma, США) в концентрации 0.5 мкг/мл. На следующий день удаляли часть монослоя (повреждали монослой наконечником для микропипетки) и добавляли rYB-1 или контрольный белок. Рану фотографировали, используя микроскоп фирмы Carl Zeiss (фазовый контраст). Скорость закрытия раны оценивали по уменьшению ее площади.
Оценка степени чувствительности клеток к цитостатикам (МТТ-тест). Клетки рассевали в 96-луночное планшеты по 5 х 103 клеток в лунку (MCF-7, HBL-100) и 10 х 103 клеток в лунку (BT-474). Препарат (цисплатин, доксорубицин, винбластин, паклитаксел) и rYB-1 (50 и 500 нг/мл), либо контрольный белок (50 и 500 нг/мл) добавляли при рассеве, клетки культивировали в течение 3 сут. Затем в лунки добавляли реагент МТТ (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 5 мг/мл в объеме 20 мкл на лунку. Через 1.5—2 ч среду с реагентом удаляли, осадок растворяли в 60 мкл ДМСО. Оптическую плотность определяли с помощью спектрофотометра Униплан при длине волны 492 нм.
Трансфекция. Клетки MCF-7 трансфицирова-ли геном N-^^^Asp12 в экспрессирующем векторе pPS-3/hygro по протоколу, описанному ранее [19]. Трансфицированные клоны отбирали по общепринятой методике с использованием гигро-мицина (100 мкг/мл) и анализировали в них наличие продукта введенного гена N-^^^Asp12 (рис. 1).
Клетки MCF-7 транфицировали плазмидой pEGFP-N3/YB-1, используя Escort IY, по протоколу, описанному ранее [11]. Контрольная плаз-мида pEGFP-N3 содержала кДНК гена GFP, кодирующего зеленый флуоресцентный белок. Обе
342
МOИCEEВА и др.
плазмиды несли селективный ген резистентности к неомицину (neo). Cелекцию клонов-трансфек-тантов проводили с помощью G418 (Invitrogen, CШЛ) в концентрации 400 мкг/мл.
Вестерн-блотинг. Общий клеточный белок выделяли в SDS-буфере по Лэммли (10% SDS, 50 мМ трис-HCl (pH 6.8), 25% глицерин, 0.05% бромофеноловый синий и 6% 2-меркаптоэтано-ла). Белковый экстракт разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (в соответствии с протоколом производителя BioRad), белки переносили на ECL-мембрану (Milli-pore, CША). Блоты инкубировали в TBS-T буфере (10 мМ трис-HCl (pH 7.4), 150 мМ NaCl и 0.05% Tween 20), содержащем 2% BSA, в течение 1 ч, а затем инкубировали с первыми антителами при 40C в течение ночи (anti-Ras/p21, clone EP1125Y, Mil-lipore; anti-Actin, clone C4, Chemicon, CША). Блоты отмывали в буфере TBS-T 3 раза по 20 мин и инкубировали со вторыми антителами (Chemi-con, CША) в течение 2 ч при комнатной температуре. Иммунокомплексы выявляли с помощью хемолюминесцентного ECL-кита.
Использование экспрессионных биочипов. Клетки MCF-7 в среде с 10% FCS рассевали на чашки Петри диаметром 35 мм по 0.5 x 106/мл. На следующий день среду заменяли свежей, содержащей 1% FCS, и добавляли rYB-1 в концентрации 500 нг/мл. Через 6 и 24 ч клетки лизировали с помощью TRI Reagent (Sigma, CША) в соответствии с протоколом производителя. Клетки MCF-7, трансфицированные генами YB1-GFP и контрольным геном GFP, рассевали на чашки Петри по 0.5 x 106/мл в среде с 10% FCS, на следующий день лизировали с помощью TRI Reagent. Затем пробы отправляли в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.