ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 5, с. 570-576
ФИЗИОЛОГИЯ животных ^^^^^^^^^^^^ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 577.151.042:577.25
ВЛИЯНИЕ ВНУТРИГИППОКАМПАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ КАИНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ПОВЕДЕНИЕ КРЫС И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МИТОХОНДРИЙ В СТРУКТУРАХ МОЗГА
© 2007 г. В. И. Архипов, Т. В. Сирота, Д. С. Лебедев
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3 E-mail: arkhipov@iteb.ru Поступила в редакцию 26.07.2006 г.
Изучали влияние внутригиппокампального введения агониста глутаматных рецепторов каиновой кислоты в двух дозах на когнитивные функции у крыс линии Вистар и функциональное состояние митохондрий в структурах мозга этих животных. Показано, что однократное введение каиновой кислоты в дозе по 0.25 мкг в дорсальную область правого и левого гиппокампа через неделю после воздействия привело к нарушению воспроизведения навыка и снижению способности ингибировать неподкрепляемые реакции. Введение каиновой кислоты в дозе 0.75 мкг привело к развитию судорожных реакций, полностью дезорганизующих поведение животных. Функциональное состояние митохондрий в структурах мозга, как важный показатель эксайтотоксичности, изучали после введения в гиппокамп тех же доз каиновой кислоты. Показано, что каиновая кислота в дозе 0.25 мкг активировала скорость фосфорилирующего дыхания митохондрий гиппокампа. Более высокая, эпилептогенная доза вещества привела к ингибированию дыхания митохондрий во фронтальной коре, незначительно повлияв на дыхание митохондрий в гиппокампе. Нарушение взаимоотношения гиппокампальной системы с фронтальной корой после внутригиппокампального введения каиновой кислоты, по-видимому, является основной причиной выявленных когнитивных дисфункций у животных.
Гиппокампальная система, активность которой определяет такие функции мозга как внимание и память, изучается в течение многих десятилетий, но конкретная роль, которую она играет в осуществлении когнитивной деятельности, точно не определена. В литературе высказываются самые разные точки зрения по этому вопросу. Среди предположений о функции гиппокампальной системы можно встретить суждение, что она осуществляет когнитивное картирование и является ключевым элементом в организации пространственной памяти (O'Keefe, Nadel, 1978; Burgess et al., 2002) и декларативной (эпизодической) памяти (Eichenbaum, 2000; Squire, 1992), участвует в распознавании объектов (Brown, Aggleton, 2001), в оценке временных интервалов (Sakata, 2006) и др. Для выявления дисфункций гиппокампа применяют такие экспериментальные тесты как обучение крыс с дистантными раздражителями в водном лабиринте Морриса (пространственная память) (Morris et al., 1982), или 8-лучевом лабиринте. Однако заслуживает внимания вывод, сделанный Виноградовой (1975) еще несколько десятилетий назад на основании анализа обширной литературы, об активации гиппокампа при таком изменении экспериментальной ситуации или элемента задания, "когда изменившиеся условия требуют не просто выработки нового следа, но заме-
ны им уже сформированного старого при сохранении прежнего комплекса обстановочных и пусковых стимулов" (Виноградова, 1975, с. 185). Число функций, отведенных гиппокампальной системе, избыточно, а потому остается актуальной задача уточнения той роли, которую эта система мозга играет в когнитивной деятельности. В настоящей работе для изучения гиппокампальной функции была применена каиновая кислота (КК) - агонист каинатной подгруппы глутаматных рецепторов. Плотность распределения каи-натных рецепторов особенно высока в хвостатом ядре, гиппокампе и мозжечке (Ben-Ari, 1985). Эффекты КК (сила вызванных судорог и объем повреждающего воздействия) в большой степени зависят от применяемой дозы. Введение КК используется как одна из наиболее адекватных моделей височной эпилепсии у человека (Ben-Ari, 1985). Экспериментальная каинатная модель эпи-лептогенеза широко используется для характеристики когнитивных нарушений, развивающихся при эпилепсии (Архипов и др., 2001; Архипов, Шевченко, 2004; Stubley-Weatherly et al., 1996). Так, например, было выявлено, что системное введение КК может нарушить способность крыс к пространственному обучению в лабиринте Морриса (Gayoso et al., 1994). Этот эффект наблюдается при обучении крыс в разные сроки по-
еле введения конвульсивной дозы КК через 10, 25, 40, 55 сут (Mikati et al., 2001). Авторы пришли к выводу, что КК вызывает нарушения на стадии приобретения информации, тогда как процесс сохранения навыка не повреждается. Обучение в лабиринте Морриса затруднено не только при системном, но и внутримозговом введении КК, в частности, микроинъекциях в дорсальную или вентральную область гиппокампа (Stubley-Weath-erly et al., 1996). Наши предыдущие исследования показали, что при системном (внутрибрюшин-ном) введении субконвульсивной дозы КК у животных можно выявить отставленные по времени нарушения поведения, если использовать тест экспериментального угашения навыка (Архипов, Шевченко, 2002). После однократного введения КК животные с трудом переключаются к новой стратегии поведения, демонстрируя продолжительную ориентировочно-исследовательскую реакцию. В настоящей работе нами продолжено изучение когнитивных функций у крыс в этих экспериментальных условиях при внутригиппо-кампальном введении каиновой кислоты.
Известно, что активность нейронов и функциональное состояние митохондрий тесно взаимосвязаны (Кудряшова, Ноздрачева, 1999; Kudin et al., 2002). Причем не только активность нейронов влияет на функционирование митохондрий, но существует и обратная связь - митохондрии способны модулировать синаптическую передачу, как это отмечено в нервно-мышечных щелевых контактах (gap junction) (Duchen, 1999). Кроме того, выявлены долговременные изменения окислительного фосфорилирования в митохондриях в ответ на увеличение синаптической активности (Kunz et al., 1999). Предполагается, что митохондрии являются одной из основных мишеней в действии КК, как нейротоксина (Dabbeni-Sala et al., 2001; Chuang et al., 2004; Milatovic et al., 2001). Для того чтобы оценить изменения, происходящие в мозге после введения КК, в настоящей работе было проведено исследование функционального состояния митохондрий в гиппокампе и для сравнения в неокортексе и мозжечке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты выполнены на крысах-самцах линии Вистар весом 180-200 г. Животных содержали в нормальных условиях со специальным режимом питания: корм крысы получали в периоды проведения поведенческих экспериментов. За период привыкания к экспериментальной обстановке животные теряли не более 20% веса по сравнению с исходным, когда животные были получены из вивария.
Выработка пищедобывателъного навыка. Обучение крыс проводили в камере (60 х 80 х 60 см), имеющей стартовую площадку и несколько целе-
вых полок, расположенных на разной высоте, на одной из которых находилось подкрепление (смоченный хлебный шарик). Для достижения полки с подкреплением крыса должна была подняться по небольшой лестнице. Перед началом обучения в течение 5 сут животные привыкали к экспериментальной обстановке, кормление в этот период проводили в экспериментальной камере в одно и то же время - один раз в сутки. Показателем обучения служило время, которое животное затрачивало на прохождение пути от стартовой площадки до целевой полки. Выработка навыка продолжалась в течение пяти суток, в каждые из которых животные совершали по 10 побежек.
Введение каиновой кислоты. После обучения животных поделили на три группы: две опытные (n = 8 в каждой группе) и одну контрольную (n = 10). Опытным крысам однократно вводили КК ("Sigma", США), растворенную в изотоническом растворе хлористого натрия. Стереотакси-ческое двустороннее введение каиновой кислоты осуществляли под действием пентобарбиталово-го наркоза (30 мг/кг). Координаты введения вещества в дорсальную область гиппокампа: АР = = -3, L = 3, Н = 3. Введение КК осуществляли с использованием микрошприца фирмы "Hamilton" (Германия); по 1 мкл раствора вводили в левую и правую доли гиппокампа в одной из двух доз: 0.25 мкг или 0.75 мкг в каждую сторону. Контрольным животным вводили в гиппокамп изотонический раствор NaCl в тех же объемах и в те же сроки, что и опытным крысам.
Поведенческие тесты. Через 7 сут после введения КК проводили проверку сохранения навыка у всех животных. Для этого крыс контрольной и опытных групп запускали в экспериментальную камеру и регистрировали время выполнения побежки к целевой полке, во время теста животные совершали по 10 попыток в сутки.
Следующий этап поведенческих экспериментов - угашение выработанного навыка. В течение двух суток животных запускали в камеру, но пищевое подкрепление они при этом не получали. Регистрировали время реакции и число совершенных неподкрепляемых реакций. Животных запускали в камеру до тех пор, пока они не прекращали побежки к целевой полке (навык считали угашенным, если животные находясь в экспериментальной камере, не забегали на целевую полку в течение 150 с; и такую реакцию они демонстрировали подряд 3 раза). Кроме того регистрировали число "автоматизированных" двигательных персевераций у животных в первые сутки угашения (побежки, совершенные животными подряд длительностью менее 10 с в 1-е сут угашения).
Исследование функционального состояния митохондрий. Функциональное состояние мито-
хондрий исследовали во фронтальной области не-окортекса, гиппокампе и мозжечке. Использовали животных, только часть из которых прошла поведенческие тесты. Через 14 сут после внутри-гиппокампального введения КК животных дека-питировали, мозг быстро извлекали, помещали в ледяной физиологический раствор, отмывали от крови и выделяли изучаемые структуры мозга. Ткань мозга взвешивали, переносили в охлажденную среду выделения, промывали этой средой и далее в ней же гомогенизировали. На 1 г ткани добавляли 2 мл среды выделения, которая имела следующий состав: 125 мМ 10 мM HEPES-^^ pH 7.4; 0.5 мM EDTA, 1 мM EGTA. Гомогенизацию ткани мозга каждого животного в отдельности проводили в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.