АГРОХИМИЯ, 2014, № 8, с. 72-78
УДК 631.528:633.491
ВЛИЯНИЕ ВСТРОЙКИ Fe-СОД! ГЕНА НА РОСТ, ПЕРЕКИСНЫЙ ГОМЕОСТАЗ И СОСТОЯНИЕ ПИГМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ
© 2014 г. И. Г. Широких1' 2, А. В. Бакулина1, С. Ю. Огородникова2, Е. Н. Баранова3, И. А. Лундовских4, А. А. Гулевич3
1 Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого РАСХН
610007 Киров, ул. Ленина, 166а, Россия E-mail: irgenal@mail.ru 2 Лаборатория биомониторинга Института биологии Коми НЦ УрО РАН и ВятГГУ 610002 Киров, ул. Красноармейская,26, Россия 3 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН
127550 Москва, ул. Тимирязевская, 42, Россия 4 Вятский государственный университет 610000 Киров, ул. Московская, 36, Россия
Поступила в редакцию 04.03.2014 г.
Проведена агробактериальная трансформация растений картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Беллароза по гену Fe-супероксиддисмутазы (Fe-СОД!). В вегетативном потомстве линий Trf 1 и Trf 2, трансгенность которых была доказана с использованием селективной среды с антибиотиком и методом ПЦР, фенотипических нарушений не обнаружено. Отсутствие достоверных различий между трансгенными и контрольными (интактными) растениями по морфометрическим и физио-лого-биохимическим параметрам свидетельствовало об отсутствии изменений у растений, получивших чужеродную вставку.
Ключевые слова: встройка Fe-СОД! гена, рост, перекисный гомеостаз, состояние пигментного комплекса, трансгенные растения картофеля, Solanum tuberosum L.
ВВЕДЕНИЕ
Адаптация растений к неблагоприятным условиям абиотической среды предполагает прохождение ими качественно различных этапов -стресс-реакции и специализированной адаптации, которая обеспечивает онтогенетическое развитие организма в условиях стресса. Это происходит только в случае, если обусловленные стрессом повреждения не превышают протекторные и репарационные возможности организма, и работа общих систем устойчивости оказывается достаточной для запуска специализированных механизмов адаптации [1]. Поэтому важным условием формирования у растений адаптивных реакций является эффективное функционирование общих систем устойчивости и среди них - антиоксидантных систем, защищающих организм от окислительного стресса, который, по мнению многих исследователей, выдвинут сегодня на роль универсального звена в реакции растительного организма на действие самых разнообразных факторов [2-4].
Одним из ключевых компонентов системы защиты клеток и тканей от окислительной деструкции является антиоксидантный фермент су-пероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1) [5]. СОД катализирует реакцию диспропорционирования супероксидных анион-радикалов до молекулярного кислорода и пероксида водорода. Супероксидные анион-радикалы могут вызывать прямые повреждающие эффекты, а также быть источником образования других, в том числе и более токсичных, форм кислорода. Поэтому клетка нуждается в строгом контроле над продукцией и своевременном удалении данных радикалов.
Литературные данные свидетельствуют, что антиокислительную активность внутри клетки можно значительно повысить введением в геном растения гена фермента СОД. Трансгенные растения, имеющие повышенные уровни СОД, демонстрировали большую устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов по сравнению с обычными растениями [6-9].
Рис. 1. Схема Т-области экспрессионного вектора с генами NPT II и Fe-СОД.
LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК; npt II - ген неомицинфосфотрансферазы II E. rnli; T-NOS - терминатор гена нопа-линсинтетазы (NOS) A. tumefaciens; P-NOS - промотор гена NOS A. tumefaciens; P-35S - промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (35SСаMV); Signal - сигнальная последовательность гена rbsc гороха (Pisum sativum L.), направляющая супероксиддисмутазу в хлоропласт; Fe-SOD - ген супероксиддисмутазы 1 из Arabidobsis thaliana.
В клетках растений СОД существует в виде 3-х изоформ, различающихся ионами металлов в активном центре и внутриклеточной локализацией. Cu/Zn-СОД была обнаружена во всех внутриклеточных компартментах, а также в апоп-ласте [5], Mn-СОД - в матриксе митохондрий и пероксисом [10], изоформа Fe-СОД преимущественно локализована в хлоропластах [11], хотя отмечена и в нефотосинтезирующих органеллах и тканях: в пероксисомах [12], цитоплазме клубеньков некоторых бобовых культур [13]. В геноме Arabidobsis thaliana (L.) Heynh содержится 7 генов, кодирующих различные виды и изофор-мы СОД. Установлено, что Fe-CОД2 и Fe-СОДз локализованы в хлоропластах. Локализация Fe-СОД1, установленная путем трансляционного слияния с GFP-белком, свидетельствует о его наличии в цитоплазме и ядре [14].
Известно, что в растительных клетках образование активных форм кислорода (АФК) наиболее интенсивно идет в хлоропластах [15]. С этим связана высокая степень выраженности в листьях общих изменений в состоянии перекис-ного гомеостаза при различных воздействиях. На основе гена Fe-SOD1 из A. thaliana была создана генетическая конструкция, снабженная сигнальной последовательностью гена rbsc гороха (Pisum sativum L.), направляющей его белковый продукт в хлоропласт. На примере модельных растений табака и томатов показано, что экспрессия гена Fe-SOD1 приводила к увеличению активности СОД в листьях и повышению выносливости трансформантов к солевому стрессу и ультрафиолетовому облучению, но в то же время вызывала изменения в ультраструктурной организации пластид и митохондрий в клетках фотосинтезирующих тканей [16].
Вместе с новым признаком трансгенный организм может приобрести и целый набор новых качеств, обусловленных как плейотропным действием нового белка, так и свойствами самой встроенной конструкции, в том числе ее нестабильностью и регуляторным действием на соседние гены [17]. Встройка чужеродной ДНК может вызывать инсерционные мутации, что сопровож-
дается каскадом изменений, непредсказуемо затрагивающих какие-либо реакции трансгенного растения, причем на разных уровнях организации [18]. Многие аспекты влияния внедренных генов на растения-трансформанты остаются в настоящее время малоизученными.
Цель работы - получение растений картофеля (Solanum tuberosum L.) с геном Fe-СОД! и комплексная оценка последствий трансформации у получивших чужеродную вставку растений на фенотипическом, физиолого-биохимическом и молекулярном уровнях.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Трансформация растений картофеля. Трансформацию осуществляли по стандартной методике. Использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0 с бинарным вектором pBI-FeСОД. Вектор содержал кассеты экспрессии целевого гена - ген Fe-супероксиддисмутазы (Fe-СОД!) из Arabidobsis thaliana, снабженный сигнальной последовательностью rbsc, обеспечивающей накопление продукта в пластидах, и маркерного гена - неомицинфосфотрансферазы (NPT II), продукт которого придает устойчивость к антибиотику канамицину. Схематическое изображение генетической конструкции, встраиваемой в геном картофеля, представлено на рис. 1.
Клетки бактерий выращивали в жидкой среде LB [19] с добавлением антибиотика канамицина 50 мг/л на качалке с круговым вращением частотой 150-200 об./мин в течение 1 сут при 25 °С.
Для трансформации был выбран сорт Белла-роза (Europlant Pflanzenzucht GMBH) из коллекции клонов, полученных в лаборатории биотехнологии растений и микроорганизмов НИИСХ Северо-Востока РАСХН. Растения размножали микрочеренкованием in vitro и выращивали при 16-часовом световом периоде и освещенности 4 кЛк на среде МС [20] с добавлением витаминов по Гамборгу и 20 мг/л сахарозы, но без гормонов. Температура воздуха составляла 23 ± 1 °С и
16 ± 1 °С (день/ночь). Растения высотой 5-6 см асептически извлекали из пробирок, разрезали на несколько частей, отделяли листья и стебли. Подготовленные таким образом экспланты культивировали в течение 2 сут на среде МС, содержащей 0.1 мг НУК/л и 2 мг/л 6-БАП/л. Инокуляцию осуществляли на 3-и сут, выдерживая экспланты с предварительно нанесенными на них насечками в суспензии агробактерий (суточная культура, разведенная в соотношении 1 : 10 смесью жидкой среды МС с экссудатом табака в равном соотношении) в течение 1 ч. Затем экспланты подсушивали на стерильной ткани в течение 5-10 мин и помещали на чашку с агаризованной МС-средой того же фитогормонального состава. Сокультиви-рование проводили в темноте в течение 2 сут при 24 °С до появления светлого агробактериального ореола. Затем экспланты отмывали стерильной дистиллированной водой и пассировали на свежую среду с добавлением необходимого для элиминации агробактерии антибиотика тиментина (тикарциллин + клавулановая кислота) в концентрации 350 мг/л. Для первичного отбора трансформированных растений на этапе регенерации в питательную среду МС вводили канамицин в концентрации 50 мг/л. После 2-х пассажей на средах с увеличенной до 500 мг/л концентрацией канамицина устойчивые к антибиотику побеги черенковали и помещали на среду МС без гормонов и антибиотиков.
Часть вегетативного потомства растений-реге-нерантов использовали для выделения ДНК [21]. Для доказательства их трансгенной природы использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Другую часть вегетативного потомства поддерживали в пробирках. У 16 пробирочных растений в каждом варианте определяли высоту побега, длину корня и количество междоузлий. Растения, несущие в составе генома чужеродную вставку, и контрольные (интактные) растения далее были вовлечены в сравнительную оценку по морфометрическим и биохимическим показателям в горшечной культуре.
ПЦР-анализ полученных растений. С целью обнаружения вставки целевого фрагмента - гена Fe-СОД1 - использовали следующую пару прай-меров:
5'-ACCTCCATTCGCACTGGATGCTTT-3' и 5' -TTCGGTGATGCAGAACTCACTGT-3',
синтезированные компанией Синтол (Россия). Амплификацию проводили на программируемом термоциклере "Терцик" (ЗАО "ДНК-Технология", Москва). Реакционная смесь (25 мкл) содержала: 1 нг ДНК, 0.1 мМ dNTPs, 0.2 мкМ каждого
праймера, 1 х PCR-буфер и 1 ед. Taq-полимеразы (SybEnzyme). ПЦР проводили в следующем режиме: 1 цикл - 94 °С, 5 мин; далее 40 циклов -94 °С, 1 мин; 65 °
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.