МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 2, с. 239-246
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 665.637
ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ НА СОСТАВ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА
© 2013 г. А. В. Панов*, **, Т. З. Есикова**, С. Л. Соколов**, И. А. Кошелева*, **, А. М. Воронин*, **
* Пущинский государственный естественнонаучный институт ** Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 01.03.2012 г.
Исследованы динамика численности и состав сообщества аборигенных почвенных микроорганизмов в условиях загрязнения почв нафталином, диоктилфталатом, дизельным топливом и нефтью. ДГГЭ-анализ 16S рДНК, амплифицированной из тотальной почвенной ДНК, выявил, что в незагрязненной почве бактериальное сообщество характеризовалось большим разнообразием, и в нем отсутствовали явно доминирующие виды. В образцах почв, загрязненных нефтью, дизельным топливом и диоктилфталатом, с третьего дня эксперимента доминировали бактерии рода Pseudomonas. При загрязнении нафталином на третьи сутки в популяции преобладали бактерии двух родов — Pseudomonas и Paenibacillus, а к 21-му дню эксперимента доминирующим стал род Arthrobacter. Количество аборигенных бактерий-деструкторов в течение эксперимента увеличилось, в среднем, на два порядка. В нативной почве не детектировались ключевые гены катаболизма нафталина — nahAc и nahH, однако уже через три дня после внесения загрязнителя они обнаруживались в значительном количестве. Из почвы, загрязненной нафталином, на третий день эксперимента были выделены три штамма-деструктора, клетки которых содержали плазмиды биодеградации нафталина группы IncP-9. Причем две из трех плазмид, будучи выделенными из клеток разных штаммов-деструкторов, оказались идентичными.
Ключевые слова: нафталин, ДГГЭ-анализ, Pseudomonas, гены nahAc и nahH.
DOI: 10.7868/S0026365613010114
В современных условиях постоянно возрастающего загрязнения окружающей среды почвенным микроорганизмам приходится сталкиваться с огромным разнообразием токсичных устойчивых органических соединений. При этом динамика микробных сообществ, изменение их состава под воздействием того или иного вида поллю-тантов изучены недостаточно. Исследование лабораторных модельных почвенных систем (МПС) дает возможность понять, как бактериальные сообщества отвечают на специфические загрязнения, и помогает устанавливать закономерности в поведении и функционировании природных сообществ при таких загрязнениях. В представленной работе в качестве загрязняющих агентов использовались нефть и дизельное топливо — широко распространенные в настоящее время многокомпонентные поллютанты окружающей среды, а также диоктилфталат и нафталин. Диок-тилфталат — токсичная жидкость, используемая в качестве пластификатора виниловых полимеров, каучуков (для получения морозостойких резино-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: panov_a_v@inbox.ru).
вых изделий), эфиров целлюлозы, полистирола, а также как гидравлическая жидкость, диэлектрическая жидкость в конденсаторах. Нафталин — низкомолекулярный ароматический углеводород, который также широко распространен в природе и часто используется как модельное соединение при исследовании процессов деструкции полициклических ароматических углеводородов (ПАУ).
Методом, который позволяет с высокой точностью проследить изменения состава бактериальных сообществ в различных экосистемах под воздействием разнообразных стрессовых факторов, является денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) [1]. С помощью ДГГЭ исследуются гены 168 рРНК всех представителей бактериального сообщества, что дает возможность определить их родовую принадлежность.
В настоящей работе данный метод использовался для наблюдения за изменениями, происходящими в лабораторных МПС в ответ на присутствие в почве распространенных поллютантов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В работе использовали серую лесную почву, отобранную близ г. Пущино Московской области и имеющую следующий состав: зола - 91.00% (SiO2 - 72.50%, С - 2.89%, H -1.05%, N - 0.25%, P - 0.06%, Ca - 0.48%, Mg -0.14%, Fe - 1.20%, K - 2.47%), pH водной вытяжки 5.5. В лабораторных условиях в почву вносили нафталин в количестве 1 мг/г почвы, нефть - 2 мкл/г почвы, дизельное топливо (ДТ) - 2 мкл/г почвы, диоктилфталат (ДОФ) - 2 мкл/г почвы. Эксперимент проводили в чашках Петри, содержащих по 20 г почвы в каждой. Чашки Петри с почвой инкубировали в термостате при температуре 28°С. Влажность почвы поддерживали на уровне 40% путем полива дистиллированной водой. Эксперимент длился 21 день, пробы отбирали на 0, 3, 10 и 21 сутки. Каждый вариант был выполнен в трех повторах. Аборигенные почвенные бактерии выделяли из почвы и выращивали на агаризованной среде LB [2] и агаризованной минерально-солевой среде Эванса [3] при 28°С. Нафталин и дизельное топливо добавляли на крышку перевернутой чашки Петри. Салицилат натрия, диоктилфталат и нефть вносили в среду в количествах 1 мл/л, 1 мл/л, 10 мл/л, соответственно. При конъюгационном переносе плазмид в качестве реципиента использовали бесплазмидный штамм P. putida KT2442 (gfp, Kmr, Rif) предоставленный K. Smalla, Германия.
Варианты МПС. Вариант I - почва + нафталин; вариант II - почва + ДТ вариант III - почва + + нефть; вариант IV - почва + ДОФ. В каждой контрольной точке эксперимента осуществляли отбор проб в количестве 250 мг для выделения тотальной почвенной ДНК. Высевы из серийных разведений почвенных проб проводили на агаризован-ную среду LB (для подсчета общей численности микроорганизмов), а также на агаризованную минеральную среду Эванса с нафталином, дизельным топливом, диоктилфталатом и нефтью (для подсчета аборигенных бактерий-деструкторов).
Выделение суммарной ДНК из почвы. Суммарную ДНК выделяли из 500 мг почвенного образца с использованием системы Fast DNA® SPIN Kit for soil ("Q-Biogene", США) по протоколу фирмы-изготовителя.
Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса [2] с некоторыми модификациями.
Конъюгационный перенос плазмид осуществляли согласно [4].
Экзополисахариды выделяли согласно [5].
Полимеразную цепную реакцию осуществляли в циклере Mastercycler Gradient ("Eppendorf", Германия). Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе, представлены в таблице. Реакции проводили в стандартных условиях с объе-
мом реакционной смеси 25 мкл. В случае ПЦР для ДГГЭ состав реакционной смеси был следующим: 1х буфер для Taq ДНК-полимеразы ("Promega", США), 1.5 мМ MgCl2, 5% DMSO, 20 пМ каждого праймера, 2 U Taq ДНК-полиме-разы, 200 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифосфа-тов и 25—100 нг ДНК. При амплификации 16S рДНК для ДГГЭ-анализа программируемый цикл был следующим: 5 мин при 94°C; амплификация 35 циклов последовательно: 1 мин при 94°C, 1 мин при 53°C и 30 с при 72°C; в заключение дополнительно 10 мин при 72°C. В случае Box-ПЦР состав смеси был следующим: 5х буфер Гитчера, 1% DMSO ("Sigma", США), 0.3 мкг праймера, 0.4 U Taq ДНК-полимеразы ("Promega", США), 1.25 мМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 0.4 мг БСА и 25—100 нг ДНК. В остальных случаях: 1х буфер для Taq ДНК-полимеразы ("Promega", США), 1.5 мМ MgCl2, 5% DMSO, 20 пМ каждого праймера, 2 U Taq ДНК-полимеразы, 200 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифос фатов и 25-100 нг ДНК.
ДГГЭ-анализ амплифицированных генов 16S рРНК проводили с использованием Dcode System ("Universal Mutation Detection System", Bio-Rad). 300-500 нг ПЦР-продукта наносили на 9% по-лиакриламидный гель [13] с градиентом от 40 до 80% (100% денатурирующий гель содержит 7М мочевины и 40% деионизованного формамида). ДГГЭ проводили в 1х Trä-acetate-EDTA буфере в течение 6.5 ч при 220 V и 60°С. Гель визуализировали путем окрашивания серебром [14]. Мажорные полосы вырезали из геля, отмывали 20 мкл 0.5% красной кровяной соли R^Fe^N)^, затем два раза по 500 мкл деионизованной стерильной водой и замораживали. После нескольких раундов замораживания-оттаивания последовательности реамплифициовали и использовали для се-квенирования.
Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems. Нуклеотидные последовательности анализировали с помощью пакета программ DNAStar и программы BLAST N (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
В рестрикционном анализе использовали следующие ферменты: для рестрикции гена 16S рРНК — RsaI, MspI (HpaII); для рестрикции плазмид — EcoRI. Обработку ДНК эндонукле-азами рестрикции проводили при 37°С в течение 2 ч в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя (все ферменты — производства "Fermentas", Литва).
Для ДНК-ДНК гибридизации образцы разделяли электрофорезом в горизонтальном агарозном геле и переносили из геля на нейлоновые фильтры "Hybon N+" ("Amersham", Англия) в раство-
ПЦР-праймеры, использованные в работе
Ген Праймеры Нуклеотидная последовательность, (5' ^ 3') Размер ПЦР-продукта, п.н. Ссылка
16S рРНК U968GC [CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCG- 440 [6]
(для ДГГЭ) L1401-1378 GGGCGGGGGCACGGGGG] CAACGCGAACCTTAC CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG
16S рРНК 27F 1492R AGAGTTTGATCMTGGCTCAG GGYTACCTTGTTACGACTT 1465 [7]
BoxA1R CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - [8]
repA RepAP7F1 GCCCATGCCGAAAAAGGTGTC 412 Волкова О.В.
(IncP-7) RepAP7R1 GAATCGTTGATAGGCATCCGAC (ИБФМ РАН)
repAB repF CCAGCGCGGTACWTGGG 398 [9]
(IncP-9) repR GTCGGCAICTGCTTGAGCTT
nahAc Ac149f Ac1014r CCCYGGCGACTATGT CTCRGGCATGTCTTTTTC 865 [10]
nahG shc1_up shc1_lo CGGCKTTHGGTGARGTCGGTGC GGCGAGGAARTAGGCGTCCTCAAG 893 [11]
nahH 23DOF 23DOR ATGGATDTDATGGGDTTCAAGGT ACDGTCADGAADCGDTCGTTGAG 721 [12]
nahR nahR_1f nahR_585r ATGGAACTGCGTGACCTGG GCCGTAGGAACAGAAGCG 585 [11]
ре 0.4 М NaOH. Перенос вели в течение 3—4 ч, после чего фильтр нейтрализовали вымачиванием в течение 5 мин в растворе 2х SSC (0.3 М NaCl, 0.03 М цитрат натрия, pH 7.0). Предгибридизацию и гибридизацию с ДНК-зондами, амплифицирован-ными с праймерами на гены nahAc и nahH и меченными диоксигенином (DIG) с использованием PCR DIG Probe Synthesis Kit ("Roche Diagnostics", Германия), проводили при 62°С (20% формамид) в гибридизационной печи "Binder
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.