ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 44, № 1, с. 49-55
УДК 557.6:581.55
ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КЛОСТРИДИЙ, ОБРАЗУЮЩИХ АЦЕТОН, БУТАНОЛ И ЭТАНОЛ
© 2008 г. О. В. Березина**, С. П. Синеокий**, Г. Ä. Великодворская*, В. Шварц***,
В. В. Зверлов*
*Институт молекулярной генетики РАН, Москва, 123182 **Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, 117545, e-mail: mashchenko@yandex.ru ***Институт микробиологии Технического университета г. Мюнхена, 85350, Фрайзинг-Вайнштефан, Германия Поступила в редакцию 22.03.2006 г.
Исследовано образование ацетона, бутанола, этанола, уксусной и масляной кислот тремя штаммами анаэробных бактерий, идентифицированных нами как Clostridium acetobutylicum. Выход ацетона и спиртов на 6%-ной мучной среде составил 12.7-15 г/л, из них доля бутанола - 51.0-55.6%. Изучена активность штаммов на ксилане, ß-глюкане, карбоксиметилцеллюлозе, кристаллической и аморфной целлюлозе. Конечная концентрация ацетона и спиртов, целлюлазная и гемицеллюлазная активность C. acetobutylicum 6, C. acetobutylicum 7 и C. acetobutylicum VKPM B-4786 была выше, чем у типового штамма C. acetobutylicum ATCC 824. Показана возможность частичной замены в среде крахмала на растительную биомассу.
Бактерии рода Clostridium - грамположительные спорообразующие палочковидные анаэробы, очень различающиеся как по физиологии, так и генетически. Например, оптимальная температура роста клостридий варьирует от 34-37°C для C. beijerinckii до 75-78°C для C. thermohydrosulfuricum. Содержание гуанозина и цитидина (ГЦ-состав) ДНК различных видов также изменяется в широких пределах: от 24% для C. pasteurianum до 55% для C. barkeri. Однако все представители рода Clostridium имеют общего предка, достаточно рано отделилившегося от грам-поло-жительных бактерий. Некоторые клостридии в качестве побочных продуктов метаболизма образуют ацетон, этанол, бутанол, изопропанол, масляную и уксусную кислоты - такие бактерии называют соль-вентогенными. В настоящее время известно пять видов сольвентогенных клостридий: C. acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sac-charobutylicum и C. ljungdahlii. Они значительно отличаются по своей способности образовывать спирты и кислоты и утилизировать питательные субстраты [1, 2]. Общим для сольвентогенных клостридий является то, что все они мезофилы с низким уровнем ГЦ-состава ДНК [3].
Процесс получения ацетона, бутанола и этанола с помощью анаэробных бактерий C. acetobutylicum является одним из старейших в биотехнологии. Он был впервые описан в конце XIX века Пастером [4] и внедрен в широкомасштабное производство в первой половине XX века Вайцманом [5]. К середине века ацетонобутиловое производство стало вторым по объему выпускаемой продукции после процесса получения этанола с помощью дрожжей. Од-
нако, развитие нефтехимической промышленности и повышение цен на традиционные субстраты (муку, кукурузный крахмал и глюкозу) привело к сокращению производства растворителей вплоть до его полного прекращения [3]. В Советском Союзе ацетонобутиловые заводы успешно функционировали до конца 80-х годов XX века. В наши дни повышение мировых цен на нефть и необходимость сокращения выбросов углекислоты в атмосферу стимулируют поиск и разработку альтернативных источников энергии. Возрождается интерес к получению бутанола с помощью клостридий. Помимо того, что бутанол активно используется в ряде отраслей химического синтеза, он со временем может частично заменить бензин и дизельное топливо, благодаря таким свойствам как высокое содержание энергии, низкая летучесть, хорошая смешиваемость, высокое октановое число.
Процесс производства бутанола может вновь стать рентабельным при использовании дешевых субстратов, в частности, растительной биомассы, основными компонентами которой являются целлюлоза и гемицеллюлоза.
Цель работы - исследование целлюлазной и ге-мицеллюлазной активности разных штаммов бута-нол-производящих клостридий, а также продукции растворителей при выращивании штаммов на субстратах, содержащих растительную биомассу.
МЕТОДИКА
Бактериальные штаммы и среды для культивирования. Штаммы Clostridium sp. 6 и Clostridium sp. 7
приобретены в коллекции Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (по данным коллекции штаммы использовались на Еф-ремовском ацетобутиловом заводе); штамм Clostridium sp. VKPM B-4786 получен из коллекции Государственного научного центра "Гос НИИ Генетика". Также в работе использовали штаммы Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, C. saccharoperbutylacetoni-cum DSM 2152, C. acetobutylicum DSM 1732 (NCIB 2951), C. beijerinckii DSM 791 (ATCC 25752, NCIB 9362) и C. acetobutylicum ATCC 824. Культивирование бактерий проводили на среде MSS (г/л): глюкоза - 60.0, дрожжевой экстракт - 5.0, NH4Ac - 3.0, KH2PO4 - 1.0, MgSO4 ■ 7H2O - 1.0, K2HPO4 - 0.8, ци-стеин-HCl - 0.5, FeSO4 ■ 7H2O - 0.050, пара-амино-бензойная кислота - 0.010. Для исследования цел-люлазной и гемицеллюлазной активности штаммов и конечных продуктов метаболизма использовали среды на основе пшеничной муки/травы: 60 г/л пшеничной муки и травы в разных пропорциях и 0.5 г/л цистеин-Hci, pH 6.5.
Для активизации спор аликвоты жидких клеточных культур разных штаммов клостридий анаэробно засевали в среду MSS в соотношении 1 : 50 и пастеризовали в водяной бане в течение 20 мин при 80°C. Затем клетки инкубировали при 30-37°C в течение 24-48 ч.
Аналитиеские методы определения ацетона, спиртов и органических кислот. Концентрацию ацетона, этанола и бутанола в культуральной жидкости определяли при помощи ГХ на приборе GC 8000 ("Thermo Finnigan", Великобритания), оснащенном колонкой Superco SPB 1000 (30 м х 0.53 мм х 0.5 мм). Концентрацию уксусной и масляной кислот определяли с помощью ИОХ на приборе DX-120 ("Dionex", США) оснащенном колонками ASM (4 мм) и AGM (4 мм). Элюцию проводили 1 мМ раствором NaOH со скоростью 1.5 мл/мин. Перед измерением очищенные центрифугированием (10000 g, 20 мин) образцы разводили в деионизованной воде в 20-50 раз. Измерения проводили как минимум три раза, погрешность измерений была менее 1%.
Определение внеклеточной целлюлазной/ге-мицеллюлазной активности. Штаммы клостридий выращивали при 37°С на мучной среде или среде, содержащей смесь муки и травы. Клетки осаждали центрифугированием при 4°C (5000 g, 15 мин). Белки культуральной жидкости концентрировали в 10 раз с помощью сульфата аммония (90% от насыщения). Для анализа целлюлазной и гемицеллюлазной активности использовали следующие субстраты (мг/мл): ксилан ("ICN Biochemicals", США) - 10, карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), ("Sigma", Германия) - 5, аморфная целлюлоза (АЦ) [6] - 10, кристаллическая целлюлоза (КЦ), ("Serva", Германия) - 10 и Р-глюкан ("Sigma", Германия) - 5 (указана рабочая концентрация субстратов). Субстраты инкубировали с концентрированным супер-натантом в 20 мМ буфере MES, pH 6.5 при 37°C от 10 мин до 24 ч. Содержание редуцирующих сахаров
измеряли с использованием динитросалицилового реагента [7]. За одну единицу активности принимали количество фермента, освобождающее 1 мкмоль D-глюкозы за 1 мин. Измерения проводили как минимум три раза, погрешность измерений составила 4%.
ПЦР-амплификация, клонирование и определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК. При работе с ДНК использовали общепринятые методики [8]. Для амплификации генов 16S рРНК в качестве матрицы брали геномную ДНК разных штаммов клостридий. Полимераз-ную цепную реакцию проводили с помощью набора реактивов puReTaqTMReady-To-GoTMPCR Beads ("Amersham", США) в соответствии с приложенным протоколом; температура отжига праймеров -50°C. Последовательность праймеров [9]:
616V 5'-AGA GTT TGA TYM TGG CTC-3';
630R 5'-CAK AAA GGA GGT GAT CC-3'
Для очистки продуктов ПЦР применяли набор реактивов Gel Extraction Kit ("Qiagen", Германия). С целью последующего секвенирования полученные фрагменты 16S рРНК генов клонировали в специализированный TüPO-вектор ("Invitrogen", США). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки TOP10F' OneShot Chemically Competent cells ("Invitrogen", США). Рекомбинантные плазми-ды выделяли с помощью Miniprep Kit ("Qiagen", Германия). Для определения нуклеотидных последовательностей рекомбинантных вставок пользовались услугами компании "Medigenomics GmbH", Германия. Нуклеотидные последовательности депонированы в базу данных EMBL, Acc. AM231182, AM231182, AM231182. В работе использовали базу данных GenBank и пакеты программ ARB [10], BLAST и CLUSTALW.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярная идентификация штаммов клостридий. Определены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК штаммов Clostridium sp. 6 (Acc. AM231182), Clostridium sp. 7 (Acc. AM231183) и Clostridium sp. VKPM B-4786 (Acc. AM231184). Сравнительный анализ последовательностей с генами 16S рРНК из базы данных GenBank показал, что гомология 16S рДНК исследуемых штаммов и Clostridium acetobutylicum ATCC 824 составляет 99%. Филогенетическое дерево, сконструированное на основе анализа генов 16S рРНК с помощью пакета программ ARB, отражает эволюционную взаимосвязь между различными видами клостридий (рис. 1).
Исследование производства ацетона и спиртов при разных температурах. Большинство промышленных штаммов Clostridium, известных на сегодняшний день, производят максимальное количество ацетона, бутанола и этанола при 30°C. Но экономически выгодным считается проведение процесса брожения при 37°C, так как при этом снижаются энергетические затраты, связанные с рек-
C. beijerinckii U16165 "Le. beijerinckii X68180 C. beijerinckii X68182
4
— C. beijerinckii S46735 C. beijerinckii X68179
— C. saccaharobutylicum U16147 C. saccharoperbutylacetonicum U16122 C. corinoforumX76742
C. favososporum X76749 C. puniceum X73444
C. botyricum
C. neonatale AF275949
^ C. botulinum
C. aurantibutylicum C. vincentii X97432
C. paraferfrindes M59102
" C. paraputrificum X75907 C. paraputrificum AB032556
C. perfringes C. butyricum
- C. gasiensis AF092548
-C. frigidicarnis AF069742
_
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.