ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 6, с. 630-636
УДК 577.151.01
ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СОДОВО-СОЛЕНЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ
© 2010 г. Е. В. Лаврентьева*, Я. Е. Дунаевский**, Л. П. Козырева*, А. А. Раднагуруева*, Б. Б. Намсараев*
*Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, 670047
e-mail: lena_l@mail.ru
**Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ,
Москва, 119991 e-mail: dun@belozersky.msu.ru Поступила в редакцию 08.10.2009 г.
Исследовано влияние источника азота на синтез протеиназ у аэробных алкалотолерантных и галотоле-рантных бактерий, выделенных из содово-соленых озер Забайкалья. Максимальное накопление протеиназ обнаружено на среде с пептоном. Введение различных источников азота в состав среды не приводило к повышению активности фермента в культуральной жидкости. Показано, что секретируемые протеиназы изученных штаммов бактерий обладают узкой субстратной специфичностью, гидролизуют белки и n-нитроанилидные субстраты, проявляя максимальную активность при гидролизе GlpAALpNA. Данные ингибиторного анализа и субстратной специфичности изученных внеклеточных ферментов указывают на их принадлежность к классу сериновых протеиназ субтилизиноподобного типа.
Содовые и содово-соленые озера широко распространены в аридных зонах Забайкалья. Они представляют собой уникальные экосистемы, в которых экстремально высокие значения рН сочетаются с высокими концентрациями солей вплоть до насыщающих [1, 2]. Алкалофильные микроорганизмы, развивающиеся в этих системах, представляют экологическую группу, которая обладает рядом физиологических особенностей, обусловленных средой обитания. Они привлекли внимание как биотехно-логически важные агенты, с одной стороны, и биохимически своеобразные организмы, приспособившиеся к существованию в условиях избытка натрия, высокого рН и ограниченной доступности ряда элементов, с другой [3]. В содовых озерах широко распространены микроорганизмы — потенциальные продуценты ферментативных систем, устойчивые к высоким значениям рН. Протеиназы микроорганизмов представляют одну из важнейших групп индустриальных ферментов, широко используемых в различных областях промышленности, медицины и молекулярной биологии [4, 5]. Исследование ферментов, секретируемых микроорганизмами, представляет значительный интерес и для экологии микроорганизмов — для понимания функционирования микробных сообществ в экстремальных условиях содовых озер.
Вместе с тем на сегодняшний день данных о внеклеточных ферментах бактерий, выделенных из содовых озер Забайкалья, явно недостаточно. Отсутствуют сведения о секретируемых протеиназах, принимающих активное участие в метаболизме азо-
тистых веществ у этих микроорганизмов, о влиянии на их активность эндогенных ингибиторов протеиназ, играющих существенную роль в защитной системе бактериальной клетки при экстремальных условиях внешней среды.
Цель работы — изучение внеклеточных протеиназ и их ингибиторов у алкалофильных бактерий содовых озер Забайкалья.
МЕТОДИКА
Объект исследования. Использовали культуры бактерий: SK1, К5, К6 и Ц3, полученные из коллекции лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН (г. Улан-Удэ). Штамм Nu был выделен и представлен для описания и исследований к.б.н. Е.Н. Болдыревой (Институт микробиологии им. С.Н. Вино-градского РАН). Все штаммы культур были выделены из донных отложений и воды содово-соленых озер Соленое и Нухэ-Нур (Забайкалье) [6].
Условия выращивания. Штаммы бактерий культивировали на среде (г/л): NH4Cl — 0.4; KH2PO4 — 0.5; MgCl2 — 0.2; Na2SO4 — 0.5; дрожжевой экстракт — 1.0. В качестве источника азота использовали: минеральный — NaNO3; органический — казеин (К), пептон (П), пептон + казеин (П+К); в конечной концентрации 1%. Оптимальные значения рН роста бактерий устанавливали карбонат-бикарбонат-ным буфером [7]. Отношение к NaCl определяли по интенсивности роста бактерий в средах с концентрацией NaCl от 0 до 300 г/л. Культуры инкубировали при 30°С на комплексной среде в течение 12—
96 ч. Клетки осаждали центрифугированием (12000 g, 15 мин), полученный супернатант использовали для определения активности протеиназ.
Активность ферментов. Общую активность измеряли по гидролизу 0.5%-ного раствора азоказеина (рН 8.0). Специфическую активность секретируе-мых протеиназ определяли, используя в качестве субстратов 5 мМ я-нитроанилиды: М-бензоил^-аргинил-я-нитроанилид (BAPA) — субстрат трипсиноподобных протеиназ, пироглутамил-аланил-аланил-лейцил-я-нитроанилид (GlpAALpNA) — субстрат субтилизинопо-добных протеиназ; пироглутамил-фенилаланил-я-нит-роанилид (GlpFpNA) — субстрат химотрипсиноподобных протеиназ; пироглютамил-фенилаланил-аланил-я-нит-роанилид (GlpFApNA) — субстрат цистеиновых про-теиназ.
При измерении активности протеиназ в ячейку микропланшета вносили 160 мкл 0.1 М фосфатного буфера, рН 7.0, добавляли 10 мкл культуральной жидкости (КЖ), 10 мкл соответствующего субстрата и измеряли оптическое поглощение раствора в нулевой момент. Затем смесь инкубировали при 37°С в течение различных промежутков времени и количество образовавшегося продукта (я-нитро-анилина) определяли спектрофотометрически при 405 нм на микропланшетном фотометре StatFax 2100 ("Awareness Technology Inc.", США) в 96-лу-ночных планшетах, используя дифференциальный фильтр 492 нм [8].
При определении активности по отношению к GlpFApNA в реакционную смесь дополнительно вносили 5 мкл свежеприготовленного раствора ди-тиотреитола (ДГГ, 10 мг/мл).
Определение оптимума pH-активности и pH-ста-бильности. При определении оптимума pH действия секретируемых протеиназ по отношению к синтетическим субстратам использовали следующие буферные растворы (0.02 М): цитратно-фос-фатный, трис-HCl и глицин-NaOH, имеющие рН в диапазоне от 2.9 до 11.6. Определение зависимости стабильности ферментов от рН проводили в тех же буферных растворах после 15 мин инкубации, затем ко всем образцам добавляли 10-кратный объем 0.1 М фосфатного буфера (pH 7.0), субстрат и определяли активность, как описано выше.
Определение температурного оптимума и температурной стабильности. Температурный оптимум ферментов определяли, измеряя активность от 30 до 80°С. Для изучения температурной стабильности растворы ферментов инкубировали при тех же температурах в течение 15 мин, затем доводили до комнатной температуры и определяли активность при 37°С, как указано выше.
Ингибиторный анализ. Для выяснения природы функциональных групп активного центра к 100 мкл раствора фермента добавляли 10 мкл раствора соответствующего ингибитора, инкубировали при 37°С, затем добавляли раствор субстрата и определяли ак-
тивность, как указано выше. В работе использовали ингибиторы сериновых протеиназ — фенилметил-сульфонилфторид (ФМСФ), трипсиноподобных протеиназ—хлорметилкетон тозил^-лизина (ТЛХК), химотрипсиноподобных протеиназ — хлорметилкетон тозилфенилаланина (ТФХК), металлопротеиназ — этилендиаминтетраацетат ^(ЭДТА), цистеиновых протеиназ — йодацетамид (ЙАА), а также активатор цистеиновых протеиназ — ДТГ
Поиск ингибиторов. Для определения активности ингибиторов по отношению к субтилизинопо-добным, трипсиноподобным, химотрипсинопо-добным и цистеиновым протеиназам использовали КЖ бактериальных штаммов, которую смешивали с 10 мкл субтилизина (0.1 мг/мл), 5 мкл бромелаина (1 мг/мл), 5 мкл трипсина (1 мг/мл) или 5 мкл химо-трипсина (5мг/мл) соответственно. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем определяли остаточную активность, используя в качестве субстратов GlpAALpNA, GlpFApNA, ВАРА или GlpF^NA, как описано выше. Определение молекулярной массы ингибитора проводили при помощи гель-фильтрации на колонке Superdex G-75 ("Pharmacia", Швеция), уравновешенной 0.01 М фосфатным буфером, рН 7.0, содержащим 0.5 М NaCl. В качестве белков-маркеров использовали БСА (68 кДа), овальбумин (45 кДа), соевый ингибитор трипсина (21.5 кДа), РНКазу (14 кДа) и цитохром с (12.4 кДа).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Использованные штаммы характеризовались способностью к росту на комплексной минеральной среде в широком диапазоне рН, вплоть до 11. Краткая характеристика исследованных штаммов представлена в табл. 1.
Внеклеточная протеолитическая активность алка-лофилов. Выделенные штаммы бактерий исследовали на способность секретировать внеклеточные протеиназы, активные на различных n-нитроани-лидных субстратах 4 групп протеиназ — трипсино-подобных, химотрипсиноподобных, субтилизино-подобных и цистеиновых (BAPA, GlpF^NA, GlpAALpNA и GlpFApNA соответственно) и на белковом субстрате азоказеине. Одним из наиболее важных факторов, определяющих активность внеклеточных ферментов, является наличие в питательной среде оптимального субстрата [9]. Нами была изучена динамика накопления внеклеточной протеолитической активности в процессе роста культур в зависимости от источника азота. Максимум секретируемой активности для штаммов Sk 1 и Nu достигался на среде с пептоном и приходился на 60 ч культивирования. Другие варианты среды с белковыми субстратами и неорганическим источником азотом практически не приводили к росту активности протеиназ. Эти результаты отличаются от результатов работ [9, 10], в которых показано на-
Таблица 1. Характеристика исследуемых штаммов
Штамм Источник выделения рНош/пределы №С1опт/преде- лы, % Т, °Сош/преде-лы Отношение к кислороду Видовая принадлежность*
Nu Вода оз. Нухэ-Нур 7.6/6.5-10.0 0.5-1.5/0-7.5 25/13-42 Строгий аэроб Представитель нового рода и вида сем. Flexibac-teriaceae (Hongiella manni-tolivoran, 89%)
Ski Донные осадки оз. Соленое 7.7/6.5-11 3.0/0-7.5 37/13-42 Строгий аэроб Представитель нового рода и вида сем. Flexibac-teriaceae (Algoriphagus sp. 10.1, 92%)
Ц3 » 10.0/6.5-11.0 10.0/0-20.0 н.о. Факультативный анаэроб Bacillus krulwichae (100%)
К5 » 10.0/6.5-11.0 3-7.5/0-20.0 н.о. Факультативный анаэроб Bacillus saliphilus (100%)
К6 » 8.5/5.8-11.0 7.5-10.0/0-20.0 н.о. Факультативный анаэроб Halomonas aguamarina (99%)
* Видовая принадлежность оценена на основании анализа последовательности г
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.