научная статья по теме ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА ОКАЗЫВАЮТ ИНГИБИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ НА ПРОДУКЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ФАГОЦИТАМИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА ОКАЗЫВАЮТ ИНГИБИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ НА ПРОДУКЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ФАГОЦИТАМИ»

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 1, с. 107-110

КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 кДа ОКАЗЫВАЮТ ИНГИБИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ НА ПРОДУКЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ФАГОЦИТАМИ

© 2015 г. Н.И. Троянова, М.А. Шевченко, А.А. Бойко, Р.Р. Мирзоев, М.А. Перцева, Е.И. Коваленко, А.М. Сапожников

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, Россия

Поступила: 12.10.2014. Принята: 15.01.2015

Активные формы кислорода (АФК), продуцируемые фагоцитирующими клетками иммунной системы, играют важную роль в первой линии защиты организма от патогенных микроорганизмов. Основным источником АФК у всех разновидностей фагоцитирующих клеток является мембрано-ассоциированный мультимолекулярный комплекс ЫЛОРН-оксидазы. Процесс формирования этого мембрано-ассоциированного ферментного комплекса и его активность зависят от многих факторов, способных как усиливать, так и подавлять интенсивность генерации АФК. Наши предыдущие данные и результаты работ других авторов указывают на то, что одно из звеньев системы ограничения уровня продукции фагоцитами АФК может быть связано с иммуномодулирующей активностью внеклеточного пула БТШ70. В настоящей работе мы использовали ряд клеточных моделей с применением ингибиторов ЫЛОРН-оксидазы для анализа возможной связи механизмов супрессирующего действия БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами с взаимодействием этого протеина с субъединицами данного ферментного комплекса. Полученные результаты подтвердили литературные сведения о способности экзогенных БТШ70 модулировать активность ЫЛЭРН-оксидазы и впервые продемонстрировали ингибирующее действие этих протеинов на интенсивность генерации АФК во внутриклеточном пространстве фагоцитов.

Ключевые слова: нейтрофилы, активные формы кислорода, ЫЛЭРН-оксидаза, белки теплового шока

ВВЕДЕНИЕ

Продукция активных форм кислорода (АФК) — одна из важных функций фагоцитов, позволяющая им осуществлять защиту организма от патогенов. Основным источником АФК, продуцируемых фагоцитирующими клетками является ЫЛОРИ-оксидаза, мембра-но-ассоциированный мультикомпонентный ферментный комплекс. Однако повышенная концентрация АФК, образующихся в местах скопления нейтрофилов, оказывает повреждающее действие и на собственные ткани организма. Ранее нами было показано, что внеклеточная форма БТШ70 может быть одним

Адрес: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, ИБХ РАН. E-mail: natywa@list.ru

из эндогенных факторов, ответственных за подавление избыточной продукции АФК [1].

БТШ70 относятся к суперсемейству стресс-индуцируемых белков теплового шока, выполняющих протективные и шаперонные функции [2]. В последние годы появляется все больше свидетельств присутствия в сыворотке крови человека и лабораторных животных циркулирующего пула БТШ70 [3]. Было также показано, что содержание сывороточных БТШ70 значительно возрастает при ряде заболеваний и в условиях стресса [4]. Мало изученными остаются источники и функции, а также причины и механизмы секреции внеклеточных БТШ70. Установлено, однако, что внеклеточные БТШ70 обладают уникальными иммуномодулирующими свойствами [5, 6]. Ранее нами была продемонстрирована

способность экзогенных БТШ70 подавлять амплитуду «окислительного взрыва» (ОВ) нейтрофилов человека в модели фагоцитоза этими клетками опсонизированного зимозана [1]. В дальнейшем этот эффект, а также возможность взаимодействия БТШ70 с NADPH-оксидазой, были продемонстрированы в работах других авторов [7, 8]. Однако механизмы регулирующего действия внеклеточных БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами остаются неизученными. Существует гипотеза, что этот эффект может быть результатом прямого взаимодействия БТШ70 с компонентами NADPH-оксидазы [9]. Для оценки такой возможности в данной работе в ряде моделей было исследовано влияние БТШ70 на процессы спонтанной и индуцированной генерации АФК в присутствии ингибиторов ферментативной активности NADPH-окси-дазы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Все реактивы приобретались в Sigma, США, кроме Polymorohprep (Axis-Shield, Норвегия), апоцинина (Calbiochem, Германия), БТШ70 (StressMarq, Канада).

Получение клеточных суспензий. Клетки костного мозга (КМ) мыши вымывали из полых костей самок мышей BALB/c («Анд-реевка», Россия) фосфатным буфером (PBS). Эритроциты удаляли с помощью лизирущего буфера. Нейтрофилы выделяли из клеток КМ мыши методом отрицательной магнитной селекции с помощью набора Neutrophil Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Германия) согласно рекомендациям производителя. Нейтрофилы человека выделяли из периферической крови доноров с помощью разделяющей среды Polymorphprep следуя рекомендациям производителя.

Регистрация АФК. Измерение общего и внеклеточного уровня АФК проводили методом люминол- и изолюминол-зависимой хемилюминисценции соответственно [10]. Белки в концентрации 5 мкг/мл добавляли в лунки за 40 мин до индукции «окислительного взрыва» (ОВ). Для индукции ОВ использовали форбол 12-миристат 13-ацетат (ФМА) [11] и хемотактический пептид ^формил-Met-Ley-Phe (fMLP) [12].

Тепловой шок. В части экспериментов клетки подвергались тепловой обработке при 43 °С в течение 10 мин, после чего следовал период восстановления 1 час при 37 °С.

Ингибиторы продукции АФК. Для подавления интенсивности продукции АФК ферментным комплексом NADPH-оксидазы использовали ингибитор его цитозольной субъединицы p47phox апоцинин [13] в концентрации 10 мкМ и ингибитор флавин-содержащих ферментов Diphenyleneiodo-nium — DPI [14] в концентрации 1 мкМ. Ингибиторы вносили в образцы клеток за 15 минут до добавления белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На клетках КМ была продемонстрирована дозозависимая индукция ОВ ФМА и fMLP. Оптимальные дозы активаторов составили 5 нг/мл ФМА и 10 мкМ fMLP. В предварительной части исследования было также показано, что тепловая обработка клеток КМ приводит к заметному снижению ФМА-индуцируемой продукции АФК.

Эксперименты по предобработке клеток КМ экзогенными БТШ70 подтвердили дозо-и время-зависимое ингибирующее действие этих белков на продукцию АФК. Так, полученные результаты показали, что добавление к образцам клеток КМ экзогенных БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и выше значительно снижает ФМА-индуцированный ОВ даже после 5-минутной инкубации. При инкубации клеток с БТШ70 в течение 40 мин уменьшение амплитуды ОВ наблюдается при концентрации белка от 0,1 мкг/мл. Также было показано, что внесение в образцы клеток КМ экзогенного БТШ70 приводит к достоверному снижению фонового уровня продукции АФК.

В опытах c регистрацией хемилюминес-ценции с помощью люминола и его изомера изолюминола, не способного проникать через клеточные мембраны, впервые было продемонстрировано, что экзогенный БТШ70 достоверно подавляет не только продукцию АФК в окружающую среду, но и генерацию кислородных радикалов во внутриклеточном пространстве. Такое действие БТШ70 было показано и в опытах с цельными популяциями клеток КМ и с фракциями выделенных нейтрофилов КМ.

Эти данные свидетельствуют о сложной комплексной реакции фагоцитов на взаимодействие с внеклеточной формой БТШ70. Нами было показано, что добавление БТШ70 как в смешанную культуру клеток КМ, так и в обогащенную культуру нейтрофилов, приводит к снижению фонового уровня вне- и

БТШ70 подавляет синтез АФК фагоцитами

109

внутриклеточных АФК уже через 1-2 мин после внесения этого протеина. Такую быструю реакцию процессов генерации АФК внутри клетки невозможно объяснить описанным в литературе феноменом интернализации внеклеточных БТШ70 различными типами клеток. В то же время, за значительно более короткий промежуток времени (около 1 минуты) после внесения БТШ70 может произойти процесс адсорбции этого протеина на клеточной поверхности и связанные с этим возможные изменения физико-химических характеристик плазматических мембран. Также указанные изменения могут прямо повлиять на ферментативную активность сложного мембрано-ассоциированного комплекса NADPH-оксидазы, но при этом нельзя исключить, что подобные мембрано-модифицирую-щие эффекты БТШ70 способны оказывать модулирующее действие этого протеина на процессы генерации АФК во внутриклеточном пространстве.

В следующей части исследования для оценки возможного вклада взаимодействия внеклеточного БТШ70 с NADPH-оксидазой в эффекты этого протеина, мы протестировали действие БТШ70 на клетки в присутствии апоцинина — специфического ингибитора сборки мембранного комплекса NADPH-оксидазы, связывающего субъединицу p47phox. Результаты практически не различались для всех исследуемых клеточных моделей. Как и ожидалось, апоцинин существенно подавлял продукцию клетками АФК. Однако, присутствие апоцинина в образцах этих клеток не отменяло ингибирующий эффект БТШ70, что указывает на то, что антиоксидантный эффект БТШ70 достигается не за счет взаимодействия с p47phox, обеспечивающей транслокацию цитозольных субъединиц NADPH-оксидазы к плазматической мембране. Возможно, что обусловленное БТШ70 снижение активности NADPH-оксидазы связано с взаимодействием этого белка с другими субъединицами ферментного комплекса.

Еще одна серия экспериментов была посвящена анализу эффектов БТШ70 в присутствии в клеточной культуре DPI — неспецифического ингибитора флавин-содержащих ферментов, к которым относится и NADPH-окси-даза, в частности, ее субъединица gp91phox, представленная на клеточной поверхности, т.е. доступная для прямого взаимодействия с внеклеточным пулом БТШ70. DPI в наших моделях существенно подавлял фоновый уровень АФК и уровень ОВ, индуцированного

ФМА и fMLP, во всех исследуемых клеточных моделях. Полученные результаты продемонстрировали, что, как и в экспериментах с апоцинином, внесение экзогенного БТШ70 в культуры клеток, инкубируемых в присутствии DPI, приводило к снижению и общего, и внеклеточного фонового уровня продукции АФК. Как и результаты, полученные с использованием апоцинина, эти данные нельзя рассматривать как свидетельство влияния БТШ70 на активность NADPH-оксидазы, но они также не исключают обусловленности зарегистрированных эффектов экзогенных БТШ70 взаимодействием с некоторыми субъединицами данного

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»