ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.234
внеклеточные мембранные нановезикулы грамотрицательных бактерий леюмошз иувюршы
и леюмомлз бльмошсюл
© 2011 г. К. А. Луста1, Ю. Е. Козловский
Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ морфологии человека РАМН, Москва
Поступила в редакцию 24.08.2010 г.
Установлено, что бактерии Леготопаз ЪуйгоркИа и Л. ва1тоте1йа, развивающиеся в чистых культурах, выделяют в окружающую среду внеклеточные мембранные нановезикулы. Методами дифференциального центрифугирования и ультрафильтрации получены препараты изолированных мембранных нановезикул и проведена визуализация этих препаратов с помощью негативного контрастирования и просвечивающей электронной микроскопии. Определены размеры нановезикул (от 10 до 300 нм в диаметре) и их ультраструктура. Наиболее многочисленные везикулы появляются вокруг бактерий, располагающихся по краям небольших колоний. Показан процесс отпочковывания везикул от бактериальной клетки. На ультратонких срезах кишечника крыс внеклеточные мембранные нановезикулы были выявлены среди скоплений пристеночных микроорганизмов разных видов. Подобные везикулы в виде цепочек из нескольких пузырьков были также обнаружены внутри гли-кокаликса между микроворсинок апикальной поверхности эпителиоцитов кишечника. На основании полученных результатов и данных литературы выдвинуто предположение, что внеклеточные мембранные нановезикулы, образуемые патогенными грамотрицательными бактериями, в данном случае Л. ЪуйгоркИа и Л. salmoniеida, являются одним из возможных механизмов патогенеза, приводящего к заболеваниям макроорганизма, а также средством межклеточных взаимодействий как внутри популяций прокариот, так и между бактериями и организмом хозяина.
Ключевые слова: внеклеточные мембранные нановезикулы, грамотрицательные бактерии, Аегото-паз kydropkila, Аеготопаз salmoniеida, просвечивающая электронная микроскопия, механизм патогенеза, межклеточные взаимодействия.
В работах последнего десятилетия показано, что ряд грамотрицательных бактерий выделяют в окружающую среду внеклеточные мембранные нановезикулы (ВМН), ограниченные внешней мембраной бактерий и содержащие внутри компоненты периплазмы [1]. Установлено также, что ВМН, выделяемые патогенными бактериями, содержат факторы вирулентности, которые могут быть средствами доставки этих факторов в ткани организма-хозяина (таблица).
Все грамотрицательные бактерии, исследованные к настоящему времени в этом аспекте, естественным образом продуцируют ВМН [22]. Расчет радиоактивно меченых белков и токсинов показал, что продуцируемые клетками бактерий нативные ВМН составляют значительную фракцию клеточного материала, достигающую 12% [23]. В целом, ВМН отражают состав внешней клеточной мембраны грамотрицательных бактерий и содержат липо-полисахариды, глицерофосфолипиды, белки внешней мембраны бактерий, а также компоненты периплазмы и цитоплазмы [1, 8]. Кроме того, показано,
1 Автор для корреспонденции (@e-mail: k_lusta@rambler.ru).
что в ВМН могут быть упакованы фрагменты плаз-мидной и хромосомной ДНК, а также ДНК бактериофагов [24].
Детальный протеомный анализ ВМН различных видов бактерий, проведенный методами двумерного электрофореза и масс-спектрометрии, выявил в изолированных везикулах более ста различных белков [12, 21]. Среди них обнаружены белки внешней мембраны бактерий (предшественник липопротеи-на АсЮ, белок рецептора внешней мембраны То1С, предшественник феррихромного белка, антиген внешней мембраны, предшественник фосфолипа-зы А1, каналообразующий белок Т8Х, предшественник порина внешней мембраны ЬС, рецептор коли-цина I, предшественник рецептора витамина В12, цитолитические токсины и другие), белки периплазмы (протеаза, глутамин-связывающий пери-плазматический белок, р-глюкозидаза, белок-переносчик липопротеина, предшественник сульфата-зы (УёеМ), цитотоксичная металлопротеаза и другие), белки цитоплазмы (шаперон ШрО, алкил-гидропероксид редуктаза, фактор элонгации Ти, флавопротеиновая субъединица сукцинатдегидро-геназы, дигидролипоамиддегидрогеназа, компо-
Факторы вирулентности, обнаруженные во внеклеточных мембранных нановезикулах различных бактерий
Виды бактерий Фактор вирулентности Ссылка
Actinobacillus pleuropneumoniae Протеазы, ApxI [2]
Actinobacillus actinomycetemcomitans Лейкотоксин [3]
Bacteroides fragilis Гемагглютинин, гидролитические ферменты [4]
Bordetella pertussis AC-Hly токсин, гемагглютинин (FHA), Pertussis токсин (Ptx) [5]
Borrelia burgdorferi Токсины OspA, OspB, OspD [6]
Burkholderia cepacia PLC-N, липаза, PSCP, 40-кДа протеаза [7]
E. coli (ETEC) Токсин LT [8]
E. coli (STEC) Шига токсин [9]
E. coli (EHEC) Цитотоксин ClyA [10]
Helicobacter pylori Токсин VacA [11]
Legionella pneumophila Mip (lpg0791), IcmK/IcmX, LaiE/LaiF, гидролитические ферменты [12]
Moraxella catarrhalis UspA1/UspA2 [13]
Neisseria meningitidis PorA, NlpB, NarE [14]
Pseudomonas aeruginosa Гемолизин, гидролитические ферменты, токсины Cif, PQS [15]
Salmonella typhi Цитотоксин ClyA [10]
Shigella flexneri Токсины IpaB, IpaC, IpaD [16]
Shigella dysenteriae Шига токсин [17]
Treponema denticola Протеазы, дентилизин [18]
Vibrio anguillarum Металлопротеиназа, гемолизин, фосфолипаза [19]
Vibrio cholerae Токсин RTX [20]
Xanthomonas campestris Целлюлаза, глюкозидаза, ксилозидаза, авирулентные белки [21]
нент дигидролипоамидсукцинилтрансферазы и другие).
Однако в настоящее время неизвестно, продуцируют ли подобные везикулы грамотрицательные бактерии рода Aeromonas. Бактерии Aeromonas Иу-drophila и А. salmonicida достаточно широко распространены в окружающей среде и способны вызывать заболевания у рыб, амфибий, моллюсков и человека [25]. Так, например, А. salmonicida вызывает фурункулез и геморрагическую бактериемию у многих видов промысловых рыб, приводящие к гибели поголовья в пресноводных водоемах и рыбных хозяйствах [26]. Инфицирование человека бактериями рода Aeromonas (в особенности А. hydrophila) приводит к развитию многих воспалительных заболеваний, таких как сепсис, менингит, пневмония, перитонит, коньюнктивит, язва роговицы, остеомиелит, гнойный артрит, миозит, абсцесс печени, холецистит, воспаление желчных путей, инфекции мочевыводящих путей, эндокардит, инфекции уха, горла и носа и другие [27].
Патогенные свойства этих бактерий определяются продукцией большого числа факторов вирулентности, включающих ферменты, такие как липаза, желатиназа, гемолизины, а также цитотоксины и энтеротоксины (мембраноповреждающие альфа- и бета-гемолизины, цитолитический энтеротоксин,
порообразующий токсин — аэролизин, термостабильный и термолабильный энтеротоксины, термостабильные и термолабильные металлопротеиназы) [28]. Отметим, что развитие инфекционных процессов, вызвываеых бактериями Aeromonas, недостаточно изучены, а механизмы выделения токсинов в виде ВМН и их взаимодействия с клетками организма-хозяина неизвестны.
Для выяснения механизмов межклеточных взаимодействий и патогенеза при инфицировании этими бактериями ценную информацию могут дать электронно-микроскопические исследования апа-тогенных и патогенных штаммов аэромонад. Поэтому целью работы было изучить ультраструктурную организацию клеток и внеклеточных мембранных нановезикул А. hydrophila и А. salmonicida в чистых культурах, а также клеток пристеночной микрофлоры различных отделов кишечника крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы. В работе использовали следующие штаммы бактерий Aeromonas hydrophila^. апа-тогенный штамм 342-1, полученный в лаб. молекулярной микроэкологии Института морфологии человека РАМН, три патогенных штамма этого вида — Е 8-8, Н 336 и Н 1-6-05 из коллекции лаб. ген-
но-инженерных препаратов НИИ ПЗК РАСХН и штамм A. salmonicida A-450 из коллекции Университета Гвелфа (Канада).
Культивирование. Все бактерии A. hydrophila выращивали на агаризованной среде LB (Луриа-Бер-тани). Для электронно-микроскопических исследований бактерии культивировали в течение 20 ч при 37°С до образования мелких колоний. Для электронной микроскопии бактерии A. salmonicida A-450 выращивали на агаризованном триптозном соевом бульоне при 22°С до образования небольших колоний. С целью получения изолированных внеклеточных мембранных везикул, образуемых этими бактериями, культуры выращивали в жидком триптозном соевом бульоне при тех же температурах в колбах Эрленмейера на качалке до начала стационарной фазы роста.
Просвечивающая электронная микроскопия.
Отдельные мелкие колонии бактерий, размером 0.5 мм, выращенные на агаризованных средах, заливали расплавленным агаром и после его застывания вырезали полностью колонию скальпелем. Материал сразу же фиксировали в растворе 0.1 М фосфатного буфера с 0.5 М NaCl (pH 7.2-7.4), содержащем смесь 0.5% глутаральдегида и 2.5% формальдегида, в течение 1.5 ч при температуре 4°С; затем трижды промывали тем же буферным раствором в течение 5 мин и фиксировали в 1% растворе OsO4 в том же буфере в течение 1.5 ч (4°С). После фиксирования материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации: 50% — 15 мин, 70% — 2 раза по 30 мин, 96% — 15 мин. Образцы пропитывали смолой LR White ("Fluka") — 96% этанол : смола (1 : 1) — 1 ч при перемешивании, затем в 100% смоле в течение ночи при перемешивании, затем в еще одной смене смолы 1 ч при перемешивании. Пропитанный материал заливали в капсулы со смолой LR White, содержащей катализатор, и проводили полимеризацию при УФ-облучении и температуре 4°С в течение 1 сут. Ультратонкие срезы получали на LKB ультрамикротоме и контрастировали в уранилацетате и цитрате свинца по Рейнольдсу.
Для негативного контрастирования 20 мкл суспензии бактериальных клеток или изолированных ВМН помещали на покрытые формваровой пленкой и углеродом никелевые сеточки для электронной микроскопии, контрастировали 2% уранилаце-татом или молибдатом аммония.
Материал просматривали и фотографировали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа Zeiss Libra 200.
Получение изолированных ВМН. Культуру A. salmonicida A-450 выращивали в жидкой среде LB до ранней стационарной фазы. Целые бактериальные клетки осаж
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.