НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 1, с. 19-26
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.152
ВНОВЬ ОБРАЗОВАННЫЕ В ЗРЕЛОМ МОЗГЕ ДОЛГОЖИВУЩИЕ НЕЙРОНЫ ВОВЛЕКАЮТСЯ В ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ОБУЧЕНИЯ И ПАМЯТИ
© 2015 г. В. В. Шерстнев1, *, М. А. Грудень1, О. Н. Голубева1, Ю. И. Александров2, О. А. Соловьева1
1ФГБУ "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина" РАМН,
2ФГБУ "Институт психологии"РАН
С помощью иммуногистохимического метода выявляли клетки, меченые ВгёИ (детекция вновь образованных клеток), (нейронспецифический маркер), е-Бо8 (маркер нейрональных пластических перестроек) и апоптотические клетки (АроБМА) в черве мозжечка, зубчатой фасции и полях СА1—СА4 гиппокампа, моторной и ретросплениальной коре правого и левого полушария мозга у взрослых крыс. Животные обучались пространственному навыку в водном лабиринте либо подвергались "мягкому" принудительному плаванию через 6 мес. после 14-дневного внутримозгового введения ВгёИ. Обнаружены значимые различия в количестве и составе меченых клеток у обученных и контрольных крыс. Документирована взаимосвязь между числом новых нервных клеток и показателями формирования долговременной пространственной памяти. Полученные результаты свидетельствуют, что вновь образованные нейроны 6-месячного возраста, а также предсуществующие нервные клетки релевантных структур мозга избирательно вовлекаются в обеспечение процессов долговременной пространственной памяти.
Ключевые слова: постнатальный нейрогенез, долгоживущие новые нейроны, обучение, долговременная память, зрелый мозг.
DOI: 10.7868/S1027813315010082
ВВЕДЕНИЕ
Одним из ведущих направлений современных исследований роли нейрогенеза (постнатального нейрогенеза) в обеспечении когнитивных функций в норме и патологии является изучение участия и функционального значения образовавшихся в зрелом мозге нейронов различного возраста в процессах обучения и памяти [1—4]. Успешное развитие указанных исследований существенно затрудняется тем, что в настоящее время имеются лишь немногочисленные экспериментальные данные о морфофункциональных свойствах и роли вновь образованных в постна-тальном онтогенезе долгоживущих нейронов, возраст которых составляет более 4—5 мес. Вместе с тем показано, что долгоживущие нервные клетки составляют значительную часть всех нейронов в мозге взрослых млекопитающих. Продолжительность жизни постнатально образованных нервных клеток сопоставима с продолжительностью жизни индивидуумов. У взрослых грызунов возраст мно-
* Адресат для корреспонденции: 125009, Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4, тел. (495) 601-2130, e-mail: sherstnev@inbox.ru.
гих новых нейронов гиппокампа и обонятельных луковиц составляет более 14—19 мес. У человека возраст вновь образованных нервных клеток коры и зубчатой фасции гиппокампа может превышать два года. С учетом постоянного нейрогенеза на протяжении жизни индивидуума возможно значительное обновление определенных популяций нейронов, в частности, нервных клеток обонятельных луковиц, дофаминэргических нейронов черной субстанции, гранулярных нейронов зубчатой фасции гиппокампа [3, 5, 6]. Следует отметить, что имеющиеся единичные экспериментальные работы о возможности участия новых долгоживущих нейронов в процессах обучения и памяти ограничиваются изучением нервных клеток зубчатой фасции гиппокампа [7, 8].
Выполненная работа направлена на исследование вовлечения вновь образованных в зрелом мозге нервных клеток 6-месячного возраста релевантных церебральных структур (различных отделов гиппокампа, черве мозжечка, моторной и ретросплениальной коре правого и левого полушария головного мозга) в процессы долговременной пространственной памяти, формирую-
19
2*
щейся у взрослых крыс при обучении в водном лабиринте.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проведено в соответствии с принципами гуманности, изложенными в директиве Европейского сообщества (86/609 ЕС) на крысах-самцах линии Wistar изначального 12-не-дельного возраста, массой тела 220—250 г (питомник лабораторных животных "Столбовая" НЦБМ, РАМН). На момент выполнения поведенческих и иммуногистохимических экспериментов животные достигали 36-недельного возраста и массы тела 450—470 г. Перед началом работы крысы были на протяжении двух недель адаптированы к условиям клиники животных института. Крыс содержали по четыре особи в клетках при постоянной комнатной температуре +21 ± 1°C и 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к пище и воде. Время проведения экспериментов с 11.00 до 15.00.
Синтетический аналог тимидина 5-Bromo-2-deoxyuridine (BrdU, Sigma, 1 мг/мл в стерильном физиологическом растворе) вводили в течение 14 дней с помощью осмотических мини-насосов (объем 200 мкл, Alzet, USA) в правый боковой желудочек мозга с скоростью 0.5 мкл/ч [9]. Мини-насосы через разрез в холке животного имплантировали подкожно и соединяли с помощью тюбинга с направляющим зондом, который вживляли в мозг с помощью стереотаксиса (TSE, Germany) по координатам B — 1; L — 1.4; H — 3.4 [10]. Через 14 дней после введения BrdU у животных в состоянии ингаляционного наркоза мини-насосы и направляющие зонды были удалены.
Спустя 6 мес. после введения BrdU животных (n = 8) обучали в водном лабиринте навыку нахождения скрытой под водой платформы. Водный лабиринт представлял собой круглый бассейн диаметром 160 см и высотой 60 см с серой внутренней поверхностью, наполненный водой (23 ± 2°C) до высоты 40 см. Расположение в бассейне прозрачной платформы диаметром 9 см, находившейся на 2 см ниже поверхности воды, как и обстановочных стимулов в экспериментальной камере, было постоянным. Крыс обучали в течение четырех дней с перерывом между сеансами в 24 ч. Во время сеанса животных помещали в воду с четырех разных случайно выбранных точек. После достижения животным платформы его оставляли на ней на 15 с, затем помещали в отдельную клетку на 60 с. Крыс, не нашедших платформу в течение 30—60 с, мягко направляли к ней. В каждой пробе фиксировали время, необходимое для достижения животным платформы. Крыс
группы "активный контроль" (n = 8) подвергали принудительному плаванию в отсутствии платформы в течение четырех дней, по четыре пробы ежедневно. Протокол экспериментов был составлен таким образом, что время плавания "контрольного" животного в каждой из проб соответствовало времени, проведенному в воде обучавшимся животным, т.е. каждому обучившемуся животному по времени и паттерну плавания соответствовала одна "контрольная особь". Группу "пассивного контроля" составили крысы (n = 6), постоянно находившиеся в домашних клетках.
Животных декапитировали через 5 мин по окончании последнего сеанса обучения или процедуры принудительного плавания. Крыс, находящихся в домашних клетках, декапировали в тот же день, что и животных других групп. Извлеченный из черепной коробки мозг крыс замораживали в жидком азоте и хранили при —80°C. В последующем готовили фронтальные срезы толщиной 20 мкм на криостате HR 400 (Микром, Германия). Границы анализируемых церебральных структур определяли в соответствии c атласом мозга крысы [10]: гиппокамп (—2.80 mm до —4.30 mm от Bregma), моторная кора (+2.5 до +3.5 mm от Bregma) и ретросплениальная кора мозга (14.0 to до 5.0 mm от Bregma), червь мозжечка (—10.52 mm до —11.6 mm от Bregma). Общее количество срезов мозга одного животного составило: гиппокамп и ретросплениальная кора (n = 75), моторная кора (n = 100), червь мозжечка (n = 50). Серийные срезы мозга фиксировали в 4%-ном параформальдегиде и подвергали первичному иммунофлюоресцентному окрашиванию для выявления BrdU, далее последовательно вторичному окрашиванию на экспрес-сируемый ранний ген с-Fos (BrdU+/с-Fos+), маркер развивающихся и зрелых нейронов — NeuN, neuron specific nuclear protein (BrdU+/NeuN+) и (NeuN+/c-Fos+), а также на маркер апоптоза — специфические фрагменты ДНК (BrdU+/ApoDNA+), (NeuN+/ApoDNA+). Выявление BrdU проводили по методу, описанному в работе [11], используя моноклональные IgG мышей к BrdU (Sigma, USA). В качестве флуоресцентной метки для выявления BrdU-позитивных клеток использовали краситель Alexa Fluor-488, конъюгированный с козьими IgG против мыши в разведении 1 : 800. С целью определения фенотипа BrdU-позитивных клеток, проводили детекцию нейронспецифиче-ского маркера — NeuN. Для выявления NeuN-по-зитивных клеток в качестве первичных антител использовали моноклональные антитела мыши к NeuN, конъюгированные с биотином (US Biological, USA) в разведении 1 : 100, с последующей обработкой стрептавидином (в разведении 1 : 100) и окрашиванием срезов конъюгатом флуоресцент-
ного красителя тирамида с антителами кролика к стрептавидину (Perkin Elmer, USA). Для определения количества клеток, экспрессирующих ранний ген с-Fos, фиксированные срезы мозга крыс отмывали (3 раза по 5 мин) 0.1 М фосфатным буфером, pH 7.4 помещали в 2.5%-ный раствор нормальной сыворотки осла на 1М фосфатным буфером, pH 7.4 осла для блокирования неспецифического связывания на 30 мин. Затем срезы подвергали инкубации с кроличьими поликло-нальными антителами против c-Fos (Calbiochem, Ab-5, Cat. #PC38, USA), в разведении 1 : 2000 на 0.1 М фосфатным буфером, pH 7.4 в течение 18 ч, после чего их отмывали (6.5 мин) 0.3%-ным Triton X-100 на 0.1 М фосфатном буфере, pH 7.4. После этого срезы обрабатывали биотинилированными козьими вторичными антителами против кролика (Vector Laboratories, USA) в разведении 1 : 300 на 0.1 М фосфатном буфере, pH 7.4 в течение 2 ч, отмывали трижды по 5 мин и помещали в раствор, содержащий 1%-ный раствор комплекса биотина с стрептовидином (PK-6101, Vector Laboratories) на 1 ч. После (45 мин) отмывания 1 М фосфатным буфером, pH 7.4 обрабатывали раствором антител к стрептовидину с флюоресцентным красителем Alexa-350 (Perkin Elmer, USA). Для контрастирования ядер использовали смесь DAPI/Antifage Solution (Chemicon, USA). Выявление BrdU-позитивных и BrdU-негативных апо-птотических клеток осуществляли с помощью коммерческих наборов ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit и ApopTag Red In Situ Apoptosis Dete^ion Kit (Chemicon, USA), основанных на детек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.