МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 2, с. 349-352
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 578.23
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ ДЕНСОВИРУСА РЫЖЕГО ТАРАКАНА Blattella germanica
© 2014 г. Е. У. Мартынова1*, Т. В. Капелинская1, C. Schal2, Д. В. Муха1*
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва, 119991 2North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, 27695-7613 USA Поступила в редакцию 08.09.2013 г. Принята в печать 15.10.2013 г.
Методом вестерн-блотинга ядерных и цитоплазматических экстрактов инфицированной денсовирусом BgDNV пересеваемой культуры клеток рыжего таракана Blattella germanica исследована внутриклеточная локализация регуляторных белков изучаемого вируса. Показано, что два белка (NS1 и NS3) характеризуются преимущественно ядерной локализацией, в то время как белок NS2 равномерно распределен между ядром и цитоплазмой. Полученные данные важны для понимания потенциальных функций регуляторных белков денсовирусов. Внутриклеточная локализация белка NS3 денсовирусов определена впервые.
Ключевые слова: локализация белков, вирусные регуляторные белки, вестерн-блотинг, денсовирусы, денсовирус рыжего таракана.
THE INTRACELLULAR LOCALIZATION OF THE REGULATORY PROTEINS OF THE DENSOVI-RUS OF GERMAN COCKROACH, Blattella germanica, by E. U. Martynova1, T. V. Kapelinskaya1, C. Schal2, D. V. Mukha1 (1Vivilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: transpozaza@rambler.ru, dmitryVmukha@gmail.com; 2North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, 27695-7613 USA). The intracellular localization of the regulatory proteins encoded by the genome of the densovirus of German cockroach was analyzed using western-blotting of nuclear and cytoplasmic extracts of the densovirus-infected passaging cells tissue culture BGE-2. Two of the three regulatory proteins, NS1 and NS3, were shown to possess mainly nuclear localization, while NS2 protein was distributed between the nucleus and cytoplasm. Data obtained provide new information necessary for prediction of the functions of densovirus regulatory proteins. Intracellular localization of NS3 protein was described for the densoviruses for the first time.
Keywords: protein localization, viral regulatory proteins, western-blotting, densoviruses, German cockroach densovirus (BgDNV).
DOI: 10.7868/S0026898414020116
Денсовирус рыжего таракана Blattella germanica (BgDNV) принадлежит к подсемейству Densoviri-nae семейства Parvoviridae. Вирусы этого подсемейства представляют собой высоковидоспецифичные возбудители летальных заболеваний насекомых и ряда ракообразных. Денсовирусы характеризуются наличием икосаэдрического капсида и отсутствием липопротеиновой оболочки. Геном денсовирусов представлен линейной одноцепочечной молекулой ДНК (4.0—6.0 т.н.). Отличительная особенность генома денсовирусов — наличие на его концах неко-дирующих палиндромных последовательностей, необходимых для репликации вирусного генома.
При анализе геномов известных денсовирусов выявлено, что они содержат две или три открытые рамки считывания (ORF), кодирующие регуляторные белки [1]. Сведения о функциях этих белков и их роли в ходе жизненного цикла денсо-вирусов на данный момент носят фрагментарный характер. Известно, что один из вирусных белков — NS1, присутствующий в геномах всех денсовирусов, — по-видимому, принимает участие в следующих процессах жизненного цикла денсовирусов: инициации репликации генома, регуляции транскрипции и инкапсидации вирусной ДНК. Белок NS1 проявляет АТР-зависимую хеликазную активность, специфическую эндонуклеазную актив-
Принятые сокращения: BgDNV — денсовирус рыжего таракана; NES — сигнал ядерного экспорта; NLS — сигнал ядерной локализации; NS1, NS2, NS3 — регуляторные белки 1, 2 и 3 денсовируса рыжего таракана.
* Эл. почта: transpozaza@rambler.ru; dmitryVmukha@gmail.com
350
МАРТЫНОВА и др.
ITR I I ITR
Рис. 1. Схема организации генома денсовируса рыжего таракана BgDNУ N8 — участок генома, кодирующий регуля-торные белки, УР — участок, кодирующий белки капсида. Черные прямоугольники — некодирующие концевые инвертированные повторы (ГГК). Стрелки — открытые рамки считывания, над стрелками указаны названия открытых рамок считывания и кодируемые ими белки. Рамки, расположенные на различных цепях генома, обозначены стрелками противоположного направления. Пунктирные стрелки — промоторы, контролирующие экспрессию белков капсида (Р1) и регуляторных белков (Р2).
ность и связывается с определенными участками вирусного генома [2, 3].
Регуляторный белок NS2 также обнаружен в геномах всех известных денсовирусов. Согласно данным Азарх (Azarkh) с соавт. [4], этот вирусный белок необходим для эффективной репликации вирусного генома и формирования новых вирусов, способных к продуктивной инфекции, хотя точная функция его остается не выясненной.
Белок NS3 найден лишь у некоторых денсовирусов. В аминокислотной последовательности NS3 присутствует мотив "цинковых пальцев" и показана необходимость экспрессии этого белка для прохождения продуктивной вирусной инфекции [5].
В отличие от NS1, для белков NS2 и NS3 характерна низкая степень гомологии среди денсовиру-сов. Это может свидетельствовать о том, что их функции специализированы в каждом денсовирусе и, скорее всего, имеют адаптационный характер [6].
Таким образом, представляется важным исследование функций регуляторных белков денсовирусов, что в дальнейшем сделает возможным понимание механизмов вирусного патогенеза, а также регуляции вирусной инфекции со стороны клетки-хозяина.
BgDNV впервые описан нами в 2000 г. [7]. Показано, что в геноме BgDNV есть три открытые рамки считывания, которые кодируют регулятор-ные белки (ORF 3—5, рис. 1). Все три белка: NS1 (ORF3; 60 кДа), NS2 (ORF4; 29 кДа) и NS3 (ORF5; 31 кДа) — экспрессируются в ходе вирусной инфекции [8].
Известно, что любой белок, в том числе вирусный, выполняет присущие ему функции в определенных компартментах клетки. Выявление внутриклеточного распределения каждого из белков денсовирусов поможет понять их роль в инфекционном цикле вируса. В представленной работе определена внутриклеточная локализация регуляторных белков BgDNV в ходе вирусной инфекции.
В рамках биоинформатического анализа аминокислотных последовательностей белков NS1,
NS2 и NS3 BgDNV, проведенного с использованием программ Wolf PSORT (http://www.psort.org) и NetNES 1.1 для поиска соответственно сигналов ядерной локализации (NLS) и ядерного экспорта (NES), выявлено присутствие ряда аминокислотных мотивов, которые могут обусловливать характер внутриклеточного распределения этих белков. Это схожие с NLS последовательности в белке NS1: PRANRR (аминокислотные остатки 239-245), RRRKRR (243-248), KKPR (514-516) - и в NS2: PALKKKI (66-72), KRKK (142-145), - а также с NES в белке NS1 (LPLEITAL, 193-200) (рис. 2). Номера аминокислотных остатков даны согласно аминокислотным последовательностям белков BgDNV, представленным в базе GenBank (AY189948). В аминокислотной последовательности белка NS3 не выявлено мотивов, сходных с известными сигналами, контролирующими ядерный транспорт.
Наиболее современным методом исследования внутриклеточной локализации служит метод им-муноцитохимии, позволяющий с применением специфических первичных антител и флуоресцентно-меченых вторичных антител продемонстрировать локализацию белка в интактной клетке. Ранее, используя методы биоинформатического анализа, мы предсказали оптимальные эпитопы в регуляторных белках NS1, NS2 и NS3 BgDNV и, пользуясь услугами фирмы "Genemed Synthesis Company" (США), получили поликлональные кроличьи антитела к коротким полипептидам (2022 аминокислотных остатка), соответствующим одному из предсказанных эпитопов для каждого белка [8]. Методом иммуноцитохимии показано, что белок NS1 локализован в ядре зараженных клеток [8]. Однако из-за низкой специфичности антител к NS2 и NS3 внутриклеточную локализацию этих вирусных белков определить не удалось, поэтому теперь мы оценили их содержание в ядерных и цитоплазматических экстрактах инфицированных клеток, применив для детекции более чувствительный метод иммуноблотинга.
В работе использована пересеваемая культура клеток рыжего таракана BGE2. Клетки растили в
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ 351
>NS1
MNYGRLT DFWSRFGVTMGDDAGRDSVSS 3 EMVEÄVGGE Р SGGPVQGQAEVT S S SVDQKLQELVDRFVS RLE EKNWKD SGYYIS DVYACE SSE RANALARRLEQRAE S FGRGFIGlFIHNNHVHTI НАС Р YT SRT CRCQPKN FPEAKE DIRRLLR К P PАIЕ Т FT RR DWENIТКY FCT S GRRAT FFKIFGHLORLPLEITALSDSTISGQDGGGPDSGVENCHDPLEFHSGPE VGDIFARPRANRRRKKRDQIWGGDGGIGGAT GIILDL/LSKCAVCFLTEIVFTKEYLQDFIVACKRLDSKE VKDAI DTRAS VI NTWEREDFVAF YNN PNTILIW SARS LNA FDS Y Y FN YEE S FNWTE L L T FQMGE NLVQFCRNLVDTLE CNI PKRNC FWC SPP SAGKNF FFDGVKDYYLNSGQMNN PNKYNQ FAYQDCHNRP. III WNE PNYE PREME N L KML FAGDNL SANVKCK PQAHVKRT PVIVLTNS L PNFCQQTAFNDRVITYHWT QAT FLKDYMKKPRPDACVDVLYSLLQ
>NS2
MAVS PT FGAALE S LWEMM PDEIAS H PATWWKLLEE S P LE DR FKDKLKS LLVRWT KN Y KNWLI GS FPALKKKIGKTVD TILAMYM P АНН LNE LMHWLDDW 5KELNLSEEDLSEYLSTIITSIQSTHAPT QAGRAGAS S RT S LKRKKTL DDC FES L QPSKRSHDETGKISQSIFVRQGDEQRSLKSL DTYKDYLLKLQLY PT LQYQAKME EDRTQAWRT AM IRINFTVDQKSG IFQRVLE LT DAVKDEIKLLLAET EESEELQE
Рис. 2. Локализация предполагаемых сигналов ядерного транспорта в белках NS1 и NS2 BgDNV, предсказанных с помощью биоинформатического анализа. Одиночным подчеркиванием выделены сигналы ядерной локализации, двойным — сигнал ядерного экспорта.
5 мл среды L-15B [9]. Заражение денсовирусом проводили путем добавления суспензии, полученной лизисом препарата ранее зараженной культуры и содержащей вирусные частицы, в культуральную среду.
Зараженные и контрольные клетки осаждали центрифугированием при 4000 об./мин в течение 5 мин, промывали три раза холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) и лизировали в течение 30 мин при 4°C в буфере 10 мМ HEPES, pH 7.9, содержащем 1.5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 0.5 мМ DTT, 0.1% Triton X-100, коктейль ингибиторов протеаз ("Sigma"). Далее ядра осаждали центрифугированием при 6 500 об./ми
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.