БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 577.29;57.086.088;617.7
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА PROX1 В СЕТЧАТКЕ ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА В ОНТОГЕНЕЗЕ
© 2014 г. Ю. В. Маркитантова, Р. Д. Зиновьева
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: yuliya.mark@gmail.com Поступила в редакцию 04.06.2013 г.
Впервые исследовано пространственно-временное распределение транскрипционного фактора PROX1 в клетках сетчатки глаза человека с 9.5-й по 31-ю нед пренатального развития и сетчатки взрослого человека. Белок PROX1 выявлен в ядрах клеток нейробластических слоев сетчатки на стадии активной пролиферации клеток (9.5 нед), в ядрах дифференцирующихся нейронов внутреннего ядерного слоя сетчатки (горизонтальных, амакриновых клетках, биполярах) с 13-й по 31-ю нед пренатального развития человека. Отмечено, что локализация белка PROX1 в сетчатке взрослого человека была такой же, как на поздних стадиях пренатального развития. Установлено участие транскрипционного фактора PROX1 в регуляции пролиферации прогениторных клеток и дифференци-ровки клеток внутреннего ядерного слоя сетчатки глаза человека, чем подтверждается консервативность функций PROX1/Prox1 в сетчатке позвоночных.
DOI: 10.7868/S0002332914020064
В регуляторной генной сети, обеспечивающей развитие и функционирование глаза позвоночных, особое место занимает ген Prox1, кодирующий многофункциональный транскрипционный фактор Proxl (Tomarev et al., 1996; Duncan et al., 2002; Dyer, 2003). В структуре гомологов Proxl/PROXl у разных видов животных (от дрозофилы до человека) идентифицированы два эволю-ционно-консервативных домена (homeo-домен и prospero-домен), обладающие ДНК-связывающей активностью, домены ядерной локализации, ядерного экспорта, домены связывания с ядерными рецепторами, ответственные за взаимодействия Proxl/PROXl и его внутриклеточную локализацию (Doe et al., l99l; Zinovieva et al, l996; Ny et al., 2005). Транскрипционный фактор Proxl участвует как в регуляции развития тканей глаза, так и в контроле формирования ряда органов и тканей: печени, поджелудочной железы, сердца, мозга и глаза, скелетных мышц, лимфатических сосудов (Wang et al., 2005; Lavado, Oliver, 2007; Johnson et al, 2008; Risebro et al., 2009).
Мыши с мутациями гена Prox1 гибнут на ранних стадиях эмбриогенеза (l5 сут), что связано с возникновением многочисленных аномалий развития (Wgle, Oliver, l999). Блокирование экспрессии гена Prox1 в нейробластах формирующегося мозга у мышей приводит к увеличению пула пролиферирующих клеток и нарушению процесса их дифференцировки. На этой же модельной системе показано участие гена Prox1 в регуляции экспрессии генов клеточного цикла E2F1, cdc25, cyclin E,p27(Kip1),p57(Kip2) в нейробластах (Torii
et al., 1999). Контролируя экспрессию генов клеточного цикла и пронейральных генов, ген Proxl играет роль бинарного переключателя между самообновлением нейральных стволовых клеток и их дифференцировкой (Choksi et al., 2006; Southa, Brand, 2009).
С помощью метода РНК-интерференции на модели развития нервной системы эмбрионов кур выявлено, что ген Prox1 участвует в инициации нейральной дифференцировки через активацию и регуляцию экспрессии bHLH-доменных пронейральных генов Mashl, Ngn2 (Mishra et al., 2008). Применение техники тканеспецифическо-го нокаута гена Prox1 показало, что в эпителии хрусталика мыши и эмбрионов кур функция этого гена проявляется в усилении пролиферации и нарушении поляризации эпителиальных клеток и дифференцировки волокон хрусталика (Wigle etal., 1999; Duncan et al., 2002). В делящихся клетках эпителия экваториальной зоны хрусталика ген Prox1 регулирует экспрессию генов-ингибиторов клеточного цикла p27 (Kipl), p57 (Kip2), контролирующих переход клеток из G1- в ¿-фазу. Оверэкспрессия гена Proxl приводит к активации, а блокирование — к снижению уровня экспрессии этих маркеров клеточного цикла, а в конечном итоге к аномальной пролиферации клеток эпителия хрусталика (Wigle et al., 1999).
Ген Proxl принимает участие в регуляторной сети, создающей специфический транскрипционный профиль нейронов развивающейся сетчатки куриного эмбриона (Boije et al., 2008). С использованием ретровирусных генетических кон-
струкций на модели развития глаза мыши доказаны решающая роль гена Proxl в регуляции выхода клеток-предшественников (нейробла-стов) сетчатки из клеточного цикла и детерминации горизонтальных клеток, а также его участие в дифференцировке амакриновых клеток и бипо-ляров. Выключение гена Proxl в сетчатке на стадии нейробластических слоев приводит к нарушению баланса между прогениторными клетками и разными типами нейронов сетчатки, что сопровождается избыточной продукцией мало-дифференцированных клеток (Dyer et al., 2003). Таким образом, экспериментальными исследованиями доказано, что общая для клеток разного типа дифференцировки функция транскрипционного фактора Proxl состоит в осуществлении контроля выхода из состояния пролиферации посредством регуляции активности ключевых генов клеточного цикла и что спектр функций транскрипционного фактора Proxl тканеспецифичен и изменяется в процессе онтогенеза.
Функции гена PROX1 в тканях глаза человека изучены недостаточно, однако понимание роли этого гена в молекулярно-генетических механизмах развития и функционирования сетчатки глаза в онтогенезе человека представляет интерес как для фундаментальной науки, так и для биомедицины. Ранее была охарактеризована структура гена PROX1 человека (Zinovieva et al., 1996) и была доказана транскрипционная активность гена PROX1 в роговице, хрусталике, сетчатке, пигментном эпителии и сосудистой оболочке развивающегося глаза человека (Маркитантова и др., 2006).
Цель работы — исследование внутриклеточной локализации белка, кодируемого геном PROX1, в сетчатке глаза в пренатальном периоде развития человека, а также в сетчатке взрослого человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом изучения служили глаза абортивных плодов человека с 9.5-й по 31-ю нед пренатально-го развития и кадаверные глаза взрослого человека (post-mortem), полученные из лицензированных учреждений Министерства здравоохранения РФ. Исследование проводилось в соответствии с биоэтическими правилами РАН и комиссии по биоэтике ИБР РАН. Возраст плодов соответствовал срокам, установленным врачом-акушером. Детально анализировали сетчатку глаза.
Для оценки морфологии тканей использовали окрашенные гематоксилином сагиттальные срезы глаза толщиной 7—10 мк. Для уточнения исследуемых стадий развития сетчатки опирались на описание морфологических преобразований в развивающемся глазу человека (Mann, 1950). Для изучения внутриклеточной локализации белка
PROX1 на криостатных срезах глаза использовали иммунопероксидазный и иммунофлуоресцент-ный методы иммунохимии. Глазные яблоки освобождали от окружающих тканей, промывали в 0.1 М фосфатном буфере - 0.1 М PBS (pH 7.4). Глаза фиксировали в 4%-ном параформальдегиде (ПАФ), приготовленном на 0.1 M PBS, с добавлением 5%-ной сахарозы. Продолжительность фиксации зависела от размера исследуемого материала и составляла от 4 (эмбриональные глаза) до 24 ч (глаза взрослого человека). Материал фиксировали при 4°С, глаза отмывали в нескольких сменах раствора 0.1 M PBS и проводили через серию растворов сахарозы возрастающей концентрации (5, 10, 20%), приготовленных на 0.1 M PBS.
Для приготовления криостатных срезов глаза замораживали в смеси, состоявшей из Tissue-Tec OCT и 20%-ной сахарозы, в соотношении 1 i 1. Криосрезы (12 мк) для морфологического и им-мунохимического исследования готовили на микротоме CM 1900 (Leica, Германия) с использованием коммерческих первичных антител к PRGX1 (Abcam, Великобритания), рабочее разведение которых составило 1 i 200, и вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем Alexa 488 (1 i 1000, Molecular Probes, США) или с пероксидазой хрена с рабочим разведением 1 i 1000 (Molecular Probes). Иммунохими-ческое исследование препаратов включало в себя следующие основные этапы! пермеабилизацию срезов в 0.1 M PBS с добавлением 0.25% Tween и 0.25% Triton Х-100, блокирование неспецифического связывания антител с использованием 3%-ного бычьего сывороточного альбумина и набора для усиления сигнала Image-iT™ FX signal enhancer (Molecular Probes) в течение 30 мин.
Срезы инкубировали с первичными антителами при 4°С в течение ночи, затем отмывали в нескольких сменах 0.1 M PBS. Реакцию связывания первичных антител с соответствующими мечеными вторичными антителами проводили при 370С в течение 2 ч, после чего срезы трехкратно отмывали 0.1 M PBS. Для окрашивания ядер клеток использовали краситель Hoechst 33342 (Leica) с рабочим разведением 1 i 1000. Срезы после проведения иммунофлуоресцентной реакции трехкратно отмывали в 0.1 M PBS, помещали под покровные стекла и заключали в среду Vectashield для имму-нофлуоресценции (Vector, США). Иммуноперок-сидазную реакцию проводили по стандартной методике с использованием реактивов из набора EnVision™ (Dako, Дания). Препараты докрашивали гематоксилином и заключали в водную среду Shandon Immu-Mount™ (Life Sciences, Великобритания).
Для контроля неспецифической иммунохими-ческой реакции параллельно проводили реакцию без первичных антител (негативный контроль).
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА PROX1
119
Рис. 1. Локализация белка PROX1 в формирующейся сетчатке глаза на разных стадиях пренатального развития человека (а, д — 9.5; б, е — 13—14; в, ж — 17; г, з — 24 нед) пренатального развития. а—г — иммунофлуоресцентная реакция; д—з — ядра клеток окрашены Hoechst 33342 (Leica). ВНС — внутренний нейробластический слой, ННС — наружный нейробластический слой, ВЯС — внутренний ядерный слой, НЯС — наружный ядерный слой, ГКЛ — ганглиозные клетки, А — амакриновые клетки, Г — горизонтальные клетки. Масштаб: 200 (а, д) и 100 мкм (б—г, е—з).
Локализация белковых продуктов была подтверждена в независимых сериях повторных экспериментов (не менее трех). Результат иммунохимиче-ской реакции анализировали с использованием микроскопа DM RXA2 (Leica) и конфокального микроскопа TCS S
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.