ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 1, с. 48-52
ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 591.339-826.17:57.053.2
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ПЕРЕДАЧА ХОЛИНЕРГИЧЕСКОГО СИГНАЛА В АМНИОНЕ КУРИНОГО ЭМБРИОНА
© 2014 г. О. В. Бойко, Б. Н. Манухин
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: boikolg@gmail.com Поступила в редакцию 04.06.2013 г.
Исследована роль системы депонированного кальция в опосредовании сократительных реакций на кар-бахол в изолированном амнионе 11—13-суточного куриного эмбриона. Обнаружено, что тапсигаргин (2 мкМ, 20 мин), ингибитор эндоплазматических Са2+-АТФаз, снижает тоническую реакцию на карба-хол на 40 ± 2%. Показано, что на фоне U73122 (5—10 мкМ, 10 мин), ингибитора фосфоинозитид-специ-фической фосфолипазы С, ритмическая сократительная реакция амниона на карбахол блокируется, а тоническая реакция снижается до 47 ± 9%. Рианодин (10 мкМ, 5 мин) блокирует спонтанную сократительную активность амниона и снижает тоническую реакцию на карбахол до 36 ± 3%, а на фоне действия рианодина нифедипин 0.05 мкМ полностью блокирует тоническую реакцию на карбахол. В реализации сократительных реакций амниона, опосредуемых МЗ-рецепторами, участвует Ca2+, мобилизуемый из внутриклеточных запасов через инозитолтрифосфатные и рианодиновые рецепторы.
DOI: 10.7868/S0002332914010032
Известно, что вещества, называемые нейро-трансмиттерами (медиаторами), синтезируются и выполняют регуляторные функции у простейших организмов, на предзародышевых и донервных стадиях развития Metazoa, в неиннервированных клетках и тканях позвоночных (Buznikov et al., 2001; Eglen, 2006). Неизменный интерес исследователей вызывают ненейрональные холинергиче-ские системы. Мембранные холинорецепторы обнаружены в эндотелиальных клетках сосудов, эпителиальных клетках респираторного тракта, раковых клетках, кератиноцитах, половых клетках, макрофагах, лимфоцитах и др. (Eglen, 2006; Kawashima, Fujii, 2008; Wessler, Kirkpatrick, 2008). При изучении природы ненервных холинергиче-ских регуляторных систем и их биологического значения в качестве экспериментальной модели могут быть использованы неиннервированные экстраэмбриональные ткани.
Холинорецепторы в амнионе куриного эмбриона опосредуют стимуляцию его сокращений: в ответ на действие холинергического агониста возрастают тонус, амплитуда и частота сокращений амниотической мембраны (Cuthbert, 1963; Бойко, Манухин, 1989а; Bowers, 1989). Спонтанная сократительная активность амниона коррелирует с уровнем дифференцированности ткани, содержанием ацетилхолина (АХ) и активностью холинэстеразы (Бункина, 1963; Полякова, 1970; Бойко, Манухин, 1989б). Реакция амниона на АХ и карбахол (КБХ) блокируется атропином (Бойко, Манухин, 1989а; Нечаева, Турпаев, 1995). Му-
скариновая природа холинорецепторов подтверждена в опытах на диссоциированных гладкомы-шечных клетках амниона (Dahm, Bowers, 1996). По аффинности к антагонистам мускариновые рецепторы амниона характеризуются как М3-хо-линорецепторы (Бойко, Манухин, 2007). Таким образом, амнион куриного эмбриона позволяет исследовать механизмы ненейронального действия АХ на М3-рецепторы гладкомышечных клеток. Активация М3-рецепторов в иннервиро-ванных гладких мышцах приводит к повышению цитоплазматической концентрации ионов кальция, которые поступают в клетку через потенциа-луправляемые кальциевые каналы и в результате выброса Са2+ в цитоплазму из саркоплазматиче-ского ретикулума (Bai et al., 2009; Wray, Burdyga, 2010). В амнионе куриного эмбриона сократительные реакции на холиномиметики в значительной степени опосредуются ионами кальция, входящими через потенциалзависимые каналы L-типа (Бойко, Манухин, 2009), роль системы депонированного кальция ранее не изучалась.
Цель работы — исследовать вклад и пути мобилизации депонированного Са2+ из саркоплазма-тического ретикулума в ответ на действие КБХ в амнионе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа проведена на изолированной полоске неиннервированного амниона 11—13-суточного куриного эмбриона. Сократительные реакции ре-
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ПЕРЕДАЧА ХОЛИНЕРГИЧЕСКОГО СИГНАЛА
49
Рис. 1. Ингибирование реакции амниона куриного эмбриона (11—13 сут) на карбахол (50 мкМ) тапсигаргином (а), Ц73122 (б), рианодином (в). Калибровка: 1 мин, 25 мг.
гистрировали в изометрическом режиме с помощью механотронов 6МХ1Б (Россия) на самописцах Н-339 и Н-399. Параллельно исследовали сокращения двух фрагментов амниона, помещенных в термостатируемые (38°C) аэрируемые камеры объемом 10 мл, содержащие раствор Хенкса следующего состава, мМ: NaCl — 137, KCl — 5.4, CaCl2 - 1.26, MgSO4 - 0.41, MgCl2 - 0.49, Na2HPO4 - 0.34, KH2PO4 - 0.44, NaHCO3 - 4.2, глюкоза - 5.6. Исходная нагрузка на препарат составляла 100 мг. Тестируемые вещества вносили в камеру в объеме 100 мкл после получасовой пре-инкубации ткани. Сократительную активность амниона стимулировали с помощью холинерги-ческого агониста КБХ (50 мкМ). Использованная концентрация агониста вызывает максимальную реакцию по частоте сокращений и субмаксимальную тоническую реакцию (Бойко, Манухин, 1989а).
Были использованы следующие реактивы: тапсигаргин (Tocris Bioscience, США), рианодин (Ascent Scientific, США), карбахол, U73122 (1-[6-[[(17beta)-3-methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl]ami-no]hexyl]-1H-pyrrole-2,5-dione) и нифедипин (Sigma, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
За высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо отвечают два типа рецепторов: рианодино-вые и рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (1Р3). Степень участия депонированного кальция в опосредуемых М3-рецепторами сократительных реакциях можно оценить, используя ингибитор эндоплазматических Са2+-АТФаз тапсигаргин, который приводит к опустошению ^-чувствительных и 1Р3-нечувствительных источников, таким образом отменяя возможность дополнительно-
го выброса Са2+ в ответ на действие холиномимети-ка. Инкубация тестируемой полоски амниона в течение 20 мин с тапсигаргином (2 мкМ) снижает тоническую реакцию на КБХ на 40 ± 2% (рис. 1а, 2а), что означает зависимость КБХ-вызванных сокращений от высвобождения внутриклеточного кальция.
Участие в реализации мускариновой реакции в амнионе ионов кальция, мобилизуемых из внутриклеточных запасов через 1Р3 -рецепторы, установлено при действии и73122. Аминостероид и73122 — ингибитор фосфоинозитид-специфи-ческой фосфолипазы С, ключевого фермента метаболизма фосфатидилинозитола. Гидролиз фос-фатидилинозитола приводит к образованию диа-цилглицерола и мобилизующего Са2+ 1Р3. На фоне и73122 (5—10 мкМ, 10 мин) ритмическая сократительная реакция амниона на КБХ отме-
4 о х
св VO ft
св
св
Я «
5 Я
се О
ft «
св М о
о ^
S Я
О
Т
% 120
80
40
■ 1
□ 2
В
Рис. 2. Реакция амниона куриного эмбриона (11 — 13 сут) на карбахол. 1 — контроль; 2 — эффект тапси-гаргина (А), Ш3122 (Б), рианодина (В). * - Р< 0.05, ** -Р < 0.01.
*
*
0
(а)
КБХ 1 10 25 50 75 мкМ
Рианодин
(б)
t t t t
КБХ 20 0.01 0.05 мкМ
Рианодин Нифедипин
Рис. 3. Влияние рианодина на сократительную реакцию амниона куриного эмбриона (11 сут), вызванную карбахолом (50 мкМ). а — кумулятивное действие рианодина, б — ингибиторное действие рианодина и блокада реакции нифедипином. Калибровка: а — 1 мин, 25 мг; б — 1 мин, 10 мг.
няется, а тоническая реакция снижается до 47 ± ± 9% (рис. 1б, 2б).
Для выявления вклада депонированного кальция, выбрасываемого в цитоплазму через риано-диновые рецепторы, исследовали активность модулятора этих рецепторов — растительного алкалоида рианодина. Воздействие рианодином (10 мкМ, 5 мин) приводит к блокаде спонтанной сократительной активности амниона и снижает тоническую реакцию на КБХ до 36 ± 3% (рис. 1в, 2в). В реакциях без выраженного тонического компонента рианодин в низкой концентрации (1 мкМ) вызывает повышение амплитуды сократительной реакции на КБХ (рис. 3а). В более высоких концентрациях (10—75 мкМ) он дозозависимо ингиби-рует амплитуду вызванных КБХ сокращений до полного их прекращения (рис. 3а). На фоне действия рианодина 20 мкМ холинергическая реакция становится высокочувствительной к нифе-дипину, блокатору потенциалзависимых кальциевых каналов Ь-типа. Нифедипин в концентрации 0.05 мкМ полностью блокирует реакцию на КБХ (рис. 3б), включая тоническую компоненту.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Провизорные экстраэмбриональные ткани привлекают возрастающее внимание исследователей по ряду причин. Установлено, что эпителиальные клетки амниона человека обладают характеристиками плюрипотентных стволовых клеток и в определенных условиях способны дифференцироваться в клетки различной тканевой принадлежности (Miki, Strom, 2006). Уникальные характеристики клеток амниона позволяют рассматривать их как потенциальный источник материала для регенеративной медицины (Toda et al., 2007; Miki et al., 2009). Показано, что клетки амниона зародышей высших позвоночных способны синтезировать и высвобождать катехоламины и аце-тилхолин (Sakuragawa et al., 2001), а также обладают рецепторами медиаторов и гормонов (Di Renzo etal., 1984; Collins, 1993). Механизмы реализации рецепторных сигналов в амниотической ткани остаются малоисследованными.
Мускариновые рецепторы амниона куриного эмбриона, опосредующие активацию его сокращений, были идентифицированы тестированием активности селективных антагонистов. В качестве М1-антагониста использовали пирензепин, М2 — метоктрамин, М3 — 4-DAMP, М4 — тропика-мид. По холинолитической активности (—lgIC50) в отношении реакции на КБХ они составили последовательность: 4-DAMP (8.29) > тропикамид (6.97) > пирензепин (5.85) > метоктрамин (5.63). Согласно полученным данным мускариновые рецепторы гладкомышечных клеток амниона куриного эмбриона относятся к М3-подтипу (Ману-хин, Бойко, 2008).
Установлено, что в ответ на действие 100 мкМ КБХ концентрация кальция в клетках амниона возрастает более чем в 10 раз по сравнению с исходной (Cross et al., 2000). Латентный период между введением агониста и последующим повышением концентрации Са2+ в клетке составлял 0.7 с. В случае прямой деполяризации плазматической мембраны путем повышения концентрации наружного К+ латентный период оказался
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.