= ОБЗОРЫ
576.311.32+33
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ВЯЗКОСТЬ: МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ И РОЛЬ В МЕТАБОЛИЗМЕ
© 2014 г. Е. О. Пучков
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 5; электронная почта:puchkov@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 29.04.2013 г.
Обзор посвящен исследованиям внутриклеточной вязкости. Дана краткая характеристика методов интегральной оценки этого показателя на уровне популяций и в индивидуальных клетках. Приведены примеры измерений вязкости цитоплазмы и некоторых органелл у разных видов клеток. Описаны результаты основных исследований in vitro и in vivo, направленных на выяснение роли вязкости в метаболизме.
Ключевые слова: цитоплазма, вязкость, ферменты, ЭПР, ЯМР, флуоресценция, компьютерный анализ изображений.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 1, с. 3-13
УДК
Б01: 10.7868/80233475513050149
Жизнь — это "одушевленная" вода.
Одна из ключевых задач клеточной биологии — изучение состава, структуры и свойств цитоплазмы. История исследований цитоплазмы началась еще в конце XIX века, и первый вопрос, по которому долгое время велись дискуссии [1]: цитоплазма — это жидкость или это гелеобразная плотная субстанция? На сегодняшний день известно, что цитоплазма живых клеток — это сложная многокомпонентная система. В зависимости от эволюционного статуса клеток в нее могут входить макромолекулярные и надмолекулярные компоненты различного состава и организации. Однако неизменно во всех клетках присутствует жидкая водная фаза, в которой протекают если не все, то значительная часть основных реакций метаболизма [2].
Вязкость, наряду с активностью воды, кислотностью и ионной силой, является одним из фундаментальным параметров водной среды, от которого зависят протекающие в ней физико-химические процессы. Вязкость можно определить как внутреннее трение текучих тел. Благодаря этому свойству при сдвиге возникает сопротивление перемещению одной их части относительно другой. Количественно вязкость характеризуется отношением напряжения сдвига (А) к градиенту скорости (Vvx) потока жидкости (1):
П = А^, (1)
где А = ¥/Ь (во избежание недоразумений традиционный символ напряжения сдвига т, который
далее в данном тексте в формуле (6) используется для обозначения времени жизни возбужденного состояния молекул, заменен на символ А), F — сила, вектор которой направлен вдоль оси х; L — площадь поперечного сечения поверхности, параллельной вектору прикладываемой силы; V vx = = (dvx/dz) — градиент скорости потока vx по направлению z, перпендикулярному вектору силы.
Это так называемая динамическая, или абсолютная вязкость. В системе СИ единицей ее измерения является (н с)/м2 или Па с (паскаль-секунда) (англ. Pa s). Однако в научной и технической литературе чаще в качестве единицы вязкости используется (дин с)/см2, которая в честь французского физиолога и физика Ж.Л. Пуазейля получила название пуаз (П, англ. P). Удобство этой единицы заключается, в частности, в том, что вязкость воды при 20°С равна 1.0020 сП. Соотношение между двумя размерностями таково: 1 П = 0.1 Па с.
При измерении вязкости с помощью так называемых капиллярных вискозиметров пользуются понятием кинематической вязкости. Она определяется как отношение динамической вязкости к плотности.
Вязкость большинства жидкостей является параметром, который в макросистеме (in vitro) зависит только от температуры и не зависит от способа измерения. Существуют и так называемые неньютоновские жидкости, у которых этот параметр зависит от прикладываемого напряжения сдвига или
от времени. Такими свойствами обладают, например, гели и пасты.
Изучение зависимости биохимических реакций от вязкости среды in vitro обеспечено достаточным арсеналом методов и приборов для измерения вязкости. Среди коммерчески доступных можно отметить вискозиметры таких фирм, как LAMYTHEOLOGY, Grace Instrument, Cole-Parmer. Это капиллярные вискозиметры, вискозиметры, основанные на регистрации падения шарика, измерения характеристик вращающихся элементов и др.
Иначе обстоит дело с измерением вязкости in vivo, в живых клетках. По чисто техническим соображениям ни один из методов, используемых in vitro, неприменим in vivo. В связи с этим разработка методов измерения внутриклеточной вязкости представляет специальную задачу.
МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ВЯЗКОСТИ
Первые подходы для измерения внутриклеточной вязкости были разработаны в середине ХХ века. Один из них был основан на измерении поведения металлических частиц в цитоплазме клеток культуры куриных фибробластов в магнитном поле. Расчетное значение вязкости цитоплазмы по результатам измерений составило около 10 П [3]. Исследовалось также броуновское движение внутриклеточных частиц (неидентифицирован-ные органеллы) в яйцах двустворчатого моллюска Spisula после их смещения к одному концу клеток центрифугированием. Значение вязкости цитоплазмы у этого объекта, измеренное данным методом, оказалось равным 4.3 сП [1]. Наконец, отметим методы с использованием радиоактивно меченных соединений. Так, в частности, анализ диффузии [3Н]инулина в зрелых ооцитах Rana pipiens позволил установить, что подвижность этого соединения в клетках составляет одну пятую подвижности в воде, что косвенно свидетельствует о более высокой по сравнению с водой вязкости цитоплазмы [4].
Однако применение описанных методов ограничилось работами авторов и широкого распространения не получило. Большая часть разработанных к настоящему времени методов измерения внутриклеточной вязкости основана на регистрации вращательной или трансляционной (поступательной) диффузии некоторых молекул-репортеров — ЭПР, ЯМР и флуоресцентных зондов. Связь вращательной и трансляционной диффузии молекул с вязкостью среды описывается уравнениями Эйнштейна-Стокса, соответственно (2) и (3):
Dr = KBT/8nnr3, (2)
D = KBT/6nnr, (3)
где Dr и D — коэффициенты вращательной и трансляционной диффузии, соответственно, KB — константа Больцмана, T — абсолютная температура, п — вязкость, r — радиус молекулы.
Измерения внутриклеточной вязкости, как правило, охватывают определенную область клетки, в которой находится зонд, и характеризуют то, что можно назвать микровязкостью. Учитывая пространственную неоднородность физических свойств цитоплазмы и/или органелл [2], a priori, следует ожидать, что результаты оценки микровязкости в клетках могут зависеть от того, диффузия какого типа выбрана за основу измерений — вращательная или трансляционная. Кроме того, эти измерения зависят от физико-химических свойств зондов, в частности, от их способности связываться с внутриклеточными структурами. Наконец, при расчетах вязкости по поведению зондов, как правило, принимаются формулы и уравнения, полученные теоретически для идеальных физических систем. Поэтому, рассматривая результаты измерения внутриклеточной вязкости разными методами, следует иметь в виду их некоторую условность. Это обстоятельство в англоязычной литературе часто подчеркивается термином apparent viscosity, что в данном контексте можно перевести как "то, что проявляется как вязкость" или "кажущаяся вязкость".
Методы измерения внутриклеточной вязкости можно разделить на две категории — методы интегральной оценки и методы измерения в индивидуальных клетках.
Методы интегральной оценки внутриклеточной вязкости
Эти методы разработаны и применяются на препаратах, содержащих сравнительно большие популяции клеток — суспензии клеток или фрагменты тканей и органов. Это позволяет получать только результаты, усредненные по исследуемой популяции. Анализ вращательной диффузии ЭПР, ЯМР и флуоресцентных зондов осуществляется путем измерения их времени вращательной корреляции, которое прямо связано с вязкостью микроокружения (4) (представлено по работе [5]):
0= 4пцг3/ЗКъТ, (4)
где 0 — время вращательной корреляции, KB — константа Больцмана, T — абсолютная температура, п — вязкость, r — радиус зонда.
Для определения внутриклеточной вязкости с помощью ЭПР применяют стабильные водорастворимые нитроксильные радикалы (спин-зонды). Один из наиболее часто используемых — 2,2,6,6-тетраметил-4-пиперидин-М-оксил (ТЕМПОН) и
его дейтерированное производное [5—9]. Они достаточно хорошо проникают в клетки, а для подавления сигнала от внеклеточного зонда измерения проводят в присутствии парамагнетика — ионов никеля (NiCl2). Время вращательной корреляции определяется непосредственно по спектрам зонда [5—12], а оценка трансляционной диффузии — по зависимости спектра от концентрации зонда [6].
По данным измерения вращательной диффузии спин-зондов вязкость цитоплазмы ряда клеток млекопитающих (культуры клеток) и конидий некоторых грибов составляла примерно 2—5 сП [6—9]. При сравнении результатов оценки вязкости по вращательной и трансляционной диффузии в клетках фибробластов линии Swiss 3T3 оказалось, что они близки (2—3 сП). Однако при создании гипертонических условий трансляционная подвижность зонда снижалась на 67%, а ротационная только на 20%. Это, по мнению авторов, может свидетельствовать о наличии в цитоплазме некоторых диффузионных барьеров [6].
Сравнительно большая вязкость зарегистрирована методом ЭПР в аскоспорах грибов Talaro-myces macrosporus (около 15 сП). Показано также, что эта величина уменьшалась при прорастании спор до значений 2—3 сП, характерных для конидий [9].
Выявлены заметные изменения подвижности спин-зондов в цитоплазме культивируемых клеток легких китайского хомячка [7] и диатомовой водоросли [10] при осмотических стрессах, у бактерий Mycobacterium tuberculosis под действием изониазида [11], в конидиях грибов Neurospora crassa при голодании по субстрату и гибели [12].
Внутриклеточную вязкость можно определять путем флуориметрического измерения анизотропии флуоресценции зондов-флуорофоров [13]. Этот подход основан на зависимости анизотропии флуоресценции от ротационной подвижности флуорофоров и тем самым от вязкости. Оценку вязкости можно осуществить одним из двух способов.
Первый позволяет измерять время вращательной корреляции (0) по временной зависимости падения анизотропии (5) и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.