МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 4, с. 496-501
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.28:57.083
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ЛЕКТИНЫ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ LENTINUS EDODES
© 2008 г. Е. П. Ветчинкина1, О. И. Соколов, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
Поступила в редакцию: 20.08.2007 г.
Из гриба Lentinus edodes на разных стадиях морфогенеза: непигментированного мицелия, коричневой мицелиальной пленки и плодового тела, выделен ряд лектинов, обладающих различным полипептидным составом и некоторыми различиями в углеводной специфичности. На стадии непигментированного мицелия обнаружено три лектина, два из которых являются димерами с молекулярной массой субъединиц 16 и 45 кДа, 16 и 42 кДа, и тетрамер, состоящий из субъединиц массой 16, 39, 42 и 45 кДа. На стадии коричневой мицелиальной пленки в составе фракций, проявляющих лектиновую активность, появляются полипептиды с молекулярной массой 24, 30 и 38 кДа, характерные только для этой морфоструктуры. На стадии плодового тела обнаружено два лектина с молекулярной массой 43 и 55 кДа. Все выделенные лектины наиболее высокое сродство проявляли по отношению к L-D-мели-биозе, D-лактозе и D-галактозе.
Ключевые слова: ЬеШтш edodes, морфогенез, лектины, анионообменная хроматография, гемаг-глютинирующая активность, углеводная специфичность.
Лектины обладают большим спектром биологических активностей, важных для жизнедеятельности клетки и организма в целом. Они играют большую роль в межклеточном связывании, в процессах передачи сигналов в биологических системах, осуществляют разнообразные функции, реализация которых зависит от природы клеток, стадии развития организма и условий окружающей среды [1, 2].
Вопрос об участии лектинов в процессе роста и развития высших базидиомицетов мало изучен. Исключение составляют три работы [3-5], в которых были сделаны предположения относительно регуляторной роли лектинов в процессе морфогенеза.
Гриб шиитаке, или черный лесной гриб (Lentinus edodes Berk. Sing или Lentinula edodes Berk. Pegler) является представителем высших ксилотрофных базидиомицетов. В мировом производстве грибов он занимает второе место после шампиньона [6] и ценится как высококачественный съедобный и лекарственный гриб [7, 8]. На протяжении последних лет проводились активные исследования по изучению внеклеточных лектинов L. edodes [9-11]. Однако в литературе имеются лишь единичные сведения о внутриклеточных лектинах гриба шиитаке, выделенных из плодовых тел [12, 13].
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: elenavetrus@yandex.ru).
Целью данной работы явилось выделение и характеристика внутриклеточных лектинов базидио-мицета Ь. edodes на разных стадиях его развития.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования. В работе был использован штамм Ьенйнш edodes F-249 из коллекции высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета. Культивирование осуществляли на среде с агаризованным пивным суслом (4° по Баллингу) при 26°С, оптимальной температуре роста для данного вида [14]. В исследовании использовали непиг-ментированный мицелий Ь. edodes на 14-е сут культивирования, коричневую мицелиальную пленку на 50-е сут культивирования и плодовые тела, которые образовывались на чашках Петри с сусло-агаром на 60-70-е сут после инокуляции [15].
Получение белковых экстрактов. Экстракты из мицелия получали следующим способом: отделение от среды выращивания, промывка дистиллированной водой, сушка при 25^, механическое измельчение и экстракция в течение 2 ч, с расчетом 10 мл экстрагирующей системы на 100 мг сухого мицелия, отделение супернатанта центрифугированием, фильтрация. Осаждение белков проводили высаливанием сульфатом аммония до конечной концентрации 85% от полного насыще-
ния. Полученную суспензию выдерживали 12 ч при 4°С, центрифугировали, осадок перерастворяли и диализовали против воды. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [16].
Гель-фильтрация. Пробы белка наносили на колонку Sephadex G-75 ("Sigma-Aldrich", США), уравновешенную 20 мМ mpuc-HCl буфером с pH 8.0. Белки элюировали при скорости потока 0.5 мл/мин тем же буфером. Выход белковых фракций регистрировали на приборе Uvicord S-II ("LKB", Швеция) при 280 нм.
Анионообменная хроматография. Белковые фракции, обладающие гемагглютинирующей активностью, концентрировали осаждением сульфатом аммония, диализовали против 20 мМ mpuc-HCl буфера (pH 8.0) и наносили на анионообмен-ную колонку Mono Q ("FPLC", Швеция). Элюцию белков осуществляли градиентом NaCl от 0 до 1 М раствора.
Гемагглютинирующая активность. Гемагглю-тинирующую активность лектинов определяли по реакции гемагглютинации, используя 2%-ную суспензию нативных и трипсинизированных эритроцитов животных и человека. Титр гемагглютинации выражали как максимальное разведение лек-тина, при которой еще отмечается агглютинация эритроцитов [17].
Углеводная специфичность. Углеводную специфичность лектинов определяли методом ингибиро-вания реакции гемагглютинации с использованием 2%-ной суспензии трипсинизированных эритроцитов кролика и стандартного набора углеводов. В качестве ингибиторов были протестированы следующие углеводы (0.3 М): D-арабиноза, L-арабиноза, D-галактоза, D-глюкоза, D-манноза, D-фруктоза, L-рамноза, L-фукоза, D-рибоза, D-сорбит, D-ман-нит, D-фруктоза, сахароза, D-ликсоза, D-ксилоза, L-талоза, D-лактоза, D-мальтоза, D-целлобиоза, D-мелибиоза, D-галактозамин, N-ацетил-О-галак-тозамин, D-глюкозамин, N-ацетил-О-глюкозамин, N-ацетил-О-маннозамин, ^^диацетил-хитобиоза, D-галактуроновая кислота, 2-дезокси-О-галактоза, D-мезоинозит, фенил-Р-О-галактопиранозид, фе-нил-Р-О-глюкопиранозид ("Sigma", США).
Электрофорез. Исследование компонентного состава лектинов проводили с помощью электрофореза в денатурирующих условиях по методу Laemmli в 15%-ом полиакриламидном геле (pH 8.3)
[18]. Образцы наносили из расчета 40 мкл на трек. В качестве стандартов молекулярной массы использовали набор белков-маркеров фирмы "Am-resco" (США): Phosphorilase B (97 кДа), Albumin (66.2 кДа), Ovalbumin (45 кДа), Carbonic anhydrase (31 кДа), Trypsin inhibitor (21.5 кДа), Lysozime (14.4 кДа). Окраску проводили нитратом серебра
[19]. Определение молекулярной массы лектинов проводили по методике Вебера и Осборна [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В целях исследования лектинов на протяжении жизненного цикла L. edodes, были выбраны характерные для данного базидиомицета стадии морфогенеза: непигментированный мицелий, коричневая мицелиальная пленка и плодовые тела. Для обнаружения полного спектра лектинов был осуществлен поиск наиболее эффективной экстрагирующей системы. Поэтому экстракцию белков гриба на каждой стадии морфогенеза проводили рядом экстрагирующих растворов: дистиллированной водой; 20 мМ mpuc-HCl буфером (pH 8.0), этим же буфером с добавлением 1 M NaCl; 3 M NaCl; 2% ДДС-Na и 10% глицерина.
Проведенные исследования показали, что из непигментированного мицелия и плодового тела наибольшее количество белков экстрагировалось 20 мМ mpuc-HCl буфером и водой, а из коричневой мицелиальной пленки 1 M NaCl. Увеличение концентрации NaCl до 3 M не приводило к существенному увеличению выхода белка, как и при использовании буфера, содержащего 2% ДДС-Na и 10% глицерина. Таким образом, было установлено, что наиболее эффективной экстрагирующей системой на стадии коричневой мицелиальной пленки является 1 M NaCl, а для непигментированного мицелия и плодовых тел - mpuc-HCl буфер.
Наиболее удобной и часто используемой тест-системой для обнаружения и определения активности лектинов является реакция гемагглютинации. Для выявления максимального спектра лектинов нами были использованы трипсинизирован-ные и нативные эритроциты кролика, барана, коровы, лошади, а также четырех групп крови человека. Наиболее чувствительным тест-объектом для лектинов L. edodes оказались трипсинизиро-ванные эритроциты кролика, в меньшей степени -человека. С эритроцитами коровы, барана и лошади лектины практически не взаимодействовали.
Хотя гемагглютинирующая активность была обнаружена в экстрактах на всех этапах морфогенеза гриба, по титру она была неодинаковой. Белки непигментированного мицелия обладали высоким титром гемагглютинации, который, однако, увеличивался по мере пигментирования и достигал своей наивысшей отметки на стадии коричневой мицелиальной пленки. Титр гемагглютинации белков плодового тела был самым низким.
Разделение белковых фракций на анионооб-менной колонке Mono Q показало, что на стадии непигментированного мицелия гемагглютинирующей активностью обладали белки трех пиков, элюция которых соответствовала концентрации NaCl в диапазоне от 0.3 М до 0.4 М (рис. 1). Их титр гемагглютинации составлял 8192, 32768 и 16384 соответственно. Определение углеводной специфичности данных лектинов показало, что наибо-
2 4 6 8 10 12 14 В
Белковые фракции
Рис. 1. Профили элюции белков L. edodes, полученные при анионообменной хроматографии на колонке Mono Q. Стадии морфогенеза: А - непигментированный мицелий; Б - коричневая мицелиальная пленка; В - плодовые тела. 1-15 - белковые фракции, полученные при анионообменной хроматографии на колонке Mono Q.
лее высокое сродство они проявили по отношению к Ь-Д-мелибиозе с минимальной ингибирующей концентрацией углевода 3 мМ, а также к Д-лакто-зе (12 мМ) и Д-галактозе (12 мМ).
Аналогичный анализ был проведен в отношении белков-лектинов коричневой мицелиальной пленки - стадии, предшествующей образованию плодовых тел. Белковые фракции, выделенные с колонки в диапазоне концентрации КаС1 от 0.25 до 0.55 М, проявляли активность с титрами гемагглю-тинации от 256 до 65536 единиц. Углеводная специфичность проявлялась по отношению к Ь-Д-ме-либиозе (3 мМ), Д-лактозе (12 мМ), Д-галактозе (12 мМ), как и в случае с непигментированным мицелием, а также к Д-галактозамину (25 мМ), К-ацетил-Д-галактозамину (25 мМ) и К-ацетил-Д-глюкозамину (25 мМ).
По сравнению с лектинами вегетативного мицелия, лектины плодовых тел не обладали высокой гемагглютинирующей активностью. На данной стадии нам удалось
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.