ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 6, с. 677-682
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.174.015.3:581.134.6
ВНУТРИВИДОВОЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ САХАРОЗОСИНТАЗЫ КАРТОФЕЛЯ СОРТОВ РОССИЙСКОЙ И КАЗАХСТАНСКОЙ СЕЛЕКЦИИ
© 2014 г. М. А. Слугина1, К. В. Борис1, 2, А. A. Какимжанова3, Е. З. Кочиева1 4
Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва 117312 e-mail: docboris@mail.ru 2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 3Национальный центр биотехнологии Казахстана, Астана 010000, Республика Казахстан 4Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра биотехнологии, Москва 119991 Поступила в редакцию 28.10.2013 г.
Впервые изучен полиморфизм глюкозилтрансферазного домена гена сахарозосинтазы 12 различных сортов картофеля российской и казахстанской селекции, а также полиморфизм фрагмента са-харозосинтазного домена данного гена у сортов казахстанской селекции. В изученных последовательностях были обнаружены как точковые мутации, так и инсерции и делеции, в том числе ранее не описанные. Также обнаружены аминокислотные замены, характерные только для жаро- и засухоустойчивых сортов, которые потенциально могут быть связаны с формированием устойчивости к абиотическому стрессу.
DOI: 10.7868/S0016675814060113
Картофель (S. tuberosum L.) занимает четвертое место в мире среди пищевых культур после пшеницы, риса и кукурузы. Известно, что урожайность картофеля в значительной степени зависит от условий выращивания и в том числе воздействия абиотического стресса. Эта зависимость у картофеля выражена сильнее, чем у многих других сельскохозяйственных растений. Так, например, воздействие водного стресса продолжительностью даже в один день может привести к заметным негативным последствиям.
В настоящее время известно, что воздействие абиотического стресса (засуха, засоление, низкие температуры) приводит к изменениям в метаболизме углеводов у растений, и многие сигнальные пути ответа на воздействие неблагоприятных факторов запускаются сахарами [1]. Показано, что сахара, подобно гормонам, могут работать в качестве первичных мессенджеров и генерировать сигналы, контролируя экспрессию различных генов, участвующих в формировании устойчивости к стрессовым факторам среды [2]. Таким образом, ферменты углеводного обмена играют важную роль для роста и развития растений в условиях абиотического стресса.
Одним из механизмов, определяющих адаптивные свойства растений картофеля к различным типам абиотического стресса, является способность взаимного превращения сахара о крахмал в цикле углеводного метаболизма [3]. На сегодняшний день известно, что в углеводный обмен в клубнях картофеля вовлечено не менее
40 ферментов, которые влияют на содержание и состав крахмала и других углеводов [4]. При этом расщепление сахарозы до глюкозы — основного компонента для синтеза крахмала — может осуществляться двумя ферментами: инвертазой и са-харозосинтазой. Сахарозосинтаза, кодируемая у S. tuberosum геном Sus4, катализирует обратимое превращение сахарозы в присутствии МДФ в МДФ-глюкозу и фруктозу и обнаруживается преимущественно в растущих клубнях картофеля [5].
Ген Sus4 картофеля относится к обширному семейству генов сахарозосинтаз Sus/SuSy, которые присутствуют у всех высших растений. На сегодняшний день у картофеля известна полная последовательность гена Sus4 [6].
Протяженность кодирующей последовательности гена Sus4 картофеля составляет 2415 пн, что соответствует белку длиной 805 а.о. с молекулярной массой около 92 кДа. Ген состоит из 14 экзо-нов. Показано, что для последовательности Sus4 картофеля характерно наличие двух доменов, определяющих основные функции белка: сахаро-зосинтазного (I—XI экзон) и глюкозилтрансферазного (XII экзон) [6]. Несмотря на то, что гены сахарозосинтазы картофеля S. tuberosum клонированы, в настоящее время недостаточно данных о нуклеотидном полиморфизме последовательностей данных генов как у сортов картофеля (S. tuberosum), так и у его сородичей.
Климатические условия Казахстана в целом неблагоприятны для выращивания картофеля:
678 СЛУГИНА и др.
Таблица 1. Сорта картофеля, выбранные для анализа
№ п.п. Сорт Страна Срок созревания* Содержание крахмала в клубнях*, % Жаро- и засухоустойчивость*
1 Аскор Казахстан Среднеспелый 18 +
2 Валентина » Раннеспелый 14.5-19 +
3 Дидар » Среднеранний 19 +
4 Карасайский » » - +
5 Мирас » » 20.3 +/-
6 Тохтар » - - +
7 Ушконир » Среднеспелый 18.8 +
8 Вестник Россия » 11.2-18 -
9 Голубизна » » 17-19 +
10 Жуковский ранний » Очень ранний 10-12 +/-
11 Раменский » Среднепоздний 14-19 -
12 Ресурс » Среднеспелый 13-16 +
* По данным сотрудников Национального центра биотехнологии Казахстана.
высокие температуры в период клубнеобразова-ния и дефицит влаги могут резко снижать урожайность данной культуры [7]. Подобный климат характерен и для части территорий России (зоны степей и полупустынь). Цель данной работы — изучение полиморфизма последовательностей основных функциональных доменов генов саха-розосинтазы у сортов картофеля российской и казахстанской селекции, выращиваемых в условиях неблагоприятного климата степных зон и полупустынь.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Были отобраны сорта картофеля Solanum tuberosum российской (пять сортов) и казахстанской селекции (семь сортов) из коллекции ВНИИКХ (Россия) и Казахского НИИ картофелеводства и овощеводства (Казахстан) (табл. 1).
ДНК выделяли из тканей 15-суточных проростков отобранных образцов согласно модифицированному протоколу с дополнительной де-протеинизацией смесью фенол/хлороформ [8].
Для амплификации были разработаны прай-меры S3EF (AACAAACTGAACGAACATGCA), R6E (TGTCGGGATAACCCAAGACA), F12E (GGTGTGTGCTCAAGGACAGG), R12E (CT-TCTCTTGGATGCGCTTCA).
ПЦР проводили по стандартному протоколу с использованием реактивов "Диалат ЛТД" (Москва) в амплификаторе "Applied Biosystems". Секвенирование проводили как с 5'-, так и c 3'-кон-цов фрагментов. Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов определяли при помощи системы Big dye ("Applied Bio-
systems") на ABI 310 cappilary DNA Analyzer (Центр "Биоинженерия", Москва). Выравнивание и анализ полиморфизма последовательностей проводили с помощью пакета программ MEGA 5.1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В анализ было включено 12 сортов картофеля Solanum tuberosum российской и казахстанской селекции с различными показателями устойчивости к абиотическим факторам, а также различным содержанием крахмала в клубнях (табл. 1).
Нуклеотидный полиморфизм анализированного участка гена Sus4
Для оценки полиморфизма были выбраны участки гена сахарозосинтазы, соответствующие основным функциональным доменам гена — са-харозосинтазному и глюкозилтрансферазному.
С помощью разработанных праймеров для каждого из отобранных образцов получены нук-леотидные последовательности, соответствующие фрагменту, кодирующему сахарозосинтазный домен (интрон III—экзон VI) и глюкозилтрансфе-разный домен гена Sus4 (экзон XII) (табл. 2).
Длина доступных для анализа последовательностей сахарозосинтазного домена (интрон III— экзон VI) у сортов картофеля варьировала от 989 пн (Ресурс) до 1026 пн (Голубизна, Вестник, Аскор). Вариабельность длины определялась инсерция-ми и делециями (индели), локализованными главным образом в интроне V (табл. 2), последовательность которого варьировала от 235 пн (Дидар,
Таблица 2. Полиморфизм в исследуемых нуклеотидных последовательностях
Участок гена Sus4 Последовательность, пн Вариабельные сайты, (%) Информативные сайты, (%) Кол-во инделей
Интрон III 83-84 5(6.17) 3(3.7) 1
Экзон IV 150 6 (4) 5(3.3) 0
Интрон IV 78-83 12 (14.8) 6 (7.4) 2
Экзон V 191 21 (10.9) 5 (2.6) 0
Интрон V 235-266 46 (18) 15 (5.87) 5
Экзон VI 247 13 (5.26) 7(2.83) 0
Экзон XII 502 13 (2.58) 7 (1.39) 0
Всего 1486-1533 116 (7.68) 48 (3.17) 8
Карасайский, Ушконир, Мирас, Ресурс, Жуковский ранний) до 266 пн (Вестник, Голубизна), что сопоставимо с данными, полученными ранее [9].
В целом, как и следовало ожидать, полиморфизм в интронных последовательностях был в 2.3 раза выше, чем в экзонах. Всего в интронах было выявлено 63 8МР8. При этом у изученных казахстанских сортов картофеля найдены восемь 8МР8, которые не были выявлены у сортов российской селекции. Российские сорта, в свою очередь, характеризовались четырьмя специфичными заменами. Интересно, что при изучении внутривидового нуклеотидного полиморфизма гена сахарозосинтазы 8ш3 у сортов риса было показано, что полиморфизм некодирующих регионов превосходил полиморфизм экзонов в 1.6 раза [10].
Интроны гена 8ш4 сортов картофеля содержали не только нуклеотидные замены, но и индели. Так, в интроне IV у ряда сортов выявлена инсер-ция TGTTAA. Последовательность интрона V характеризовалась наличием инсерции 30 пн (TAGTCCCATTCATTGATAGGTTTAATTTGT) у сортов Аскор, Валентина, Вестник, Голубизна. Кроме того, в последовательности интрона V гена 8ш4 казахстанского сорта Тохтар, полученного
методами клеточной селекции из материала, отобранного в космосе, детектированы две специфичные инсерции (TAACATA, образованная путем дупликации, и ХТ), которые отсутствуют у других изученных сортов, а также у ранее описанных 8ш4 последовательностей [9] (рис. 1).
Все полученные последовательности можно разделить на четыре группы по наличию инсер-ций в интронах (не принимая во внимание моно-и динуклеотидные) (рис. 2). Первая группа сформирована образцами Дидар, Карасайский, Ушконир, Ресурс, Жуковский ранний, последовательности которых характеризуются отсутствием ин-делей. Ко второй группе можно отнести сорта Аскор, Валентина, Вестник, Голубизна, имеющих две инсерции: 6- и 30-нуклеотидные в интронах IV и V соответственно. В третью группу входят сорта Раменский и Мирас, имеющие только 6-нуклео-тидную вставку в интроне IV. А четвертая группа представлена единственным сортом Тохтар, в 8ш4 последовательности которого выявлены сор-тоспецифичные инсерции, описанные выше. Аналогичное деление сортов на группы по присутствию единичных нуклеотидных замен и ин-делей в последовательностях гена сахарозосинта-зы было показано для 8ш3 риса, при этом также
DIDAR
TOHTAR
KARASAIS
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.