научная статья по теме ВОДОРАСТВОРИМЫЕ НЕСТЕХИОМЕТРИЧНЫЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ МОДИФИЦИРОВАННОГО ХИТОЗАНА Физика

Текст научной статьи на тему «ВОДОРАСТВОРИМЫЕ НЕСТЕХИОМЕТРИЧНЫЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ МОДИФИЦИРОВАННОГО ХИТОЗАНА»

Высокомолекулярные соединения

Серия А

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2011, том 53, № 4, с. 515-524

ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТЫ

УДК 541(64+49):547.995.12

ВОДОРАСТВОРИМЫЕ НЕСТЕХИОМЕТРИЧНЫЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ МОДИФИЦИРОВАННОГО ХИТОЗАНА1 © 2011 г. В. А. Изумрудов*, И. Ф. Волкова**, Э. С. Григорян**, М. Ю. Горшкова**

*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова. Химический факультет 119991 Москва, Ленинские горы **Учреждение Российской академии наук Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН 119991 Москва, Ленинский пр., 29 Поступила в редакцию 13.10.2010 г. Принята в печать 03.12.2010 г.

Алкилированием первичных аминогрупп хитозана глицидилтриметиламмоний хлоридом синтезирован модифицированный полисахарид, несущий практически в каждом деацетилированном звене функциональную вторичную аминогруппу и кватернизованную аминогруппу, обеспечивающую положительный заряд и растворимость полимера во всем диапазоне рН. Смешением раствора модифицированного хитозана с растворами полистиролсульфонатных или полиметакриалатных анионов в нейтральных средах получены отрицательно заряженные нестехиометричные полиэлектролитные комплексы, растворимые и стабильные при физиологических условиях. Выявлено влияние рН, ионной силы, степени полимеризации и природы лиофилизирующего полианиона, а также заряд зарядового соотношения компонентов на границы существования растворимых комплексов. Полученные данные могут составить основу для разработки биосовместимых и биодеградируемых средств доставки генетического материала и лекарственных веществ в живые клетки.

ВВЕДЕНИЕ

Природный полисахарид хитозан представляет собой продукт деацетилирования хитина — одного из наиболее распространенных природных полимеров. Биосовместимость, биодеградируе-мость, разнообразная биологическая активность, а также низкая токсичность хитозана обусловливают его широкое использование в медицине и фармакологии от покрытий на раны и ожоги до систем направленной доставки лекарств [1—3].

Протонирование первичных аминогрупп обеспечивает положительный заряд и растворимость макромолекул хитозана в кислых средах, а также их способность электростатически взаимо-

1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 10-03-00019-а).

E-mail: izumrud@genebee.msu.ru (Изумрудов Владимир Алексеевич).

действовать с полианионами и анионными биополимерами. Результаты многочисленных исследований полиэлектролитных комплексов хитоза-на проанализированы и обобщены в обзорах [4, 5]. Подавляющее большинство работ посвящено описанию способов получения и исследованию свойств нерастворимых комплексов. Формированию растворимых комплексов препятствуют неоднородность образцов хитозана, выделяемых из природного сырья, сравнительно узкая область рН, где хитозан растворим, и специфическая структура этого катионного полисахарида, определяющая его склонность к образованию водородных связей, способствующих возникновению макромолекулярных агрегатов.

Особый интерес вызывает возможность использования этого биосовместимого и биодегра-дируемого катионного полисахарида в качестве вектора для доставки генетического материала в клетку. Смешением растворов хитозана и ДНК в

слабо кислых средах удалось получить растворимые комплексы [6, 7], но переход в нейтральные среды, приводящий к депротонированию аминогрупп, вызывал существенное увеличение размеров частиц, а при рН > 6.5 комплексы теряли растворимость. Попытки расширения области существования растворимых комплексов путем использования кватернизованных производных хитозана [8, 9] осложнялись наличием в продуктах модификации аминогрупп различной степени замещения и О-алкилированных фрагментов. Композиционная неоднородность образцов оказывала негативное влияние на растворимость и свойства комплексов. Сшитые специальным образом олигомеры хитозана [10] сохраняли растворимость в нейтральных средах вплоть до рН 7.4 и заметно увеличивали эффективность трансфек-ции (т.е. доставки ДНК в ядра клеток), однако для признания данного подхода перспективным необходимы физико-химические и биологические исследования комплексов. Помимо узкого интервала устойчивости растворимые комплексы хитозана с нуклеиновыми кислотами оказались весьма чувствительными к присутствию белков сыворотки крови [11]. Использование высокомолекулярных образцов хитозана (М > 105) позволило несколько ослабить связывание белков, но при этом снижалась устойчивость растворимых комплексов к изменению рН и ионной силы раствора. Таким образом, проблема получения растворимых комплексов хитозана с нуклеиновыми кислотами, стабильных при физиологических условиях (рН 7.2, 0.14 М №С1) остается важной нерешенной задачей.

В литературе имеются работы по растворимым комплексам хитозана с анионными полисахаридами, в частности гепарином [12, 13], декстран-сульфатом и альгинатом натрия [14—18]. Для получения комплексов авторам [12, 13] пришлось подвергать суспензию смеси растворов хитозана и гепарина многократному фильтрованию. Понятно, что такой путь должен сопровождаться неизбежными потерями полимеров и приводить к большим ошибкам определения состава комплексов. Растворимые комплексы хитозана с декстрансульфатом готовили смешением компонентов в концентрированных (6 М) растворах мочевины [14, 15], что вряд ли можно считать удачным, поскольку использование подобных комплексов для доставки физиологически активных соединений в клетки не представляется возможным из-за денатурирующего действия мочевины на биополимеры. Прозрачные системы получали смешением растворов хитозана с декстрансуль-фатом или альгинатом натрия в существенно не-эквимольном соотношении [16—18], причем смеси растворялись при достижении определенного избытка как отрицательно заряженных групп полианионов, так и положительно заряженных ами-

ногрупп полисахарида. Растворимые комплексы декстрансульфата агрегировали при рН > 6.0 и концентрации хлористого натрия выше 0.10 моль/л. Продукты взаимодействия хитозана с альгинатом натрия были чуть стабильнее, сохраняя растворимость вплоть до рН 6.4. Таким образом, и для комплексов хитозана с анионными полисахаридами пока не удалось получить растворимых продуктов, устойчивых при физиологических условиях.

Дальнейшее продвижение в этой области требует изучения влияния природы и молекулярных характеристик полимеров (длины цепи, плотности заряда), а также внешних условий (рН, ионной силы, температуры) на комплексообразова-ние. Удобным партнером хитозана в подобных модельных исследованиях может служить линейный синтетический полистиролсульфонатный анион (ПСС), несущий в каждом звене сульфо-натную группу, которая практически полностью ионизована во всем исследуемом диапазоне рН. Немаловажным обстоятельством, определяющим успешное проведение опытов, является доступность коммерческих препаратов ПСС в виде хорошо охарактеризованных узких фракций различной ММ.

Результаты первой работы [19] в серии модельных исследований взаимодействия хитозана и ПСС-аниона [19—22] продемонстрировали возможность получения растворимых нестехиомет-ричных полиэлектролитных комплексов в сильно кислых средах. Однако необходимость проведения опытов в условиях, далеких от физиологических, существенно ограничивало изучение и практическое применение комплексов.

Снять упомянутое ограничение удалось с помощью приема, разработанного ранее [23] для получения растворимых комплексов, содержащих полианион в качестве лиофилизирующего компонента. Готовили сильно кислые растворы хитозана и ПСС-аниона, которые затем смешивали в неэквимольном заряд-зарядовом соотношении (полианион в значительном избытке), формируя растворимые нестехиометричные полиэлектролитные комплексы (НПЭК). Данный этап приготовления комплексов полностью соответствовал процедуре, описанной в работе [19]. На финальной стадии в системы добавляли раствор щелочи до нейтральных значений рН [20, 21]. Указанная последовательность действий позволила избежать фазового разделения, которое возникает при прямом смешении растворов хито-зана и полианиона в нейтральных и слабо кислых средах. Приготовленные комплексы оставались растворимыми и стабильными вплоть до рН 7.2, отвечая критериям поведения водорастворимых НПЭК. При всей своей привлекательности такой путь получения НПЭК тоже не лишен недостатков. Не всякий анионный биополимер (белок,

фермент, нуклеиновая кислота) сохраняет свои функциональные свойства в сильно кислых средах, необходимых для осуществления первого этапа приготовления растворимых комплексов с хитозаном. Кроме того, даже незначительное подщелачивание среды при рН > 7.2 приводило к кооперативному разрушению системы ионных пар из-за депротонирования аминогрупп полисахарида, включенного в состав комплекса.

Настоящая работа представляет собой следующий важный этап проводимых модельных исследований. Основой послужило использование химически модифицированного поликатиона, который получали алкилированием первичных аминогрупп хитозана глицидилтриметиламмо-ний хлоридом [22]. Высокозаряженный и однородный по структуре полимер содержал в каждом модифицированном звене два типа аминогрупп — кватернизованную аминогруппу, обеспечивающую положительный заряд цепей и их растворимость во всем диапазоне рН, а также вторичную аминогруппу, способную (де)протонироваться при изменении кислотности среды. Специфика строения и свойства модифицированного хитоза-на позволили готовить комплексы в мягких условиях простым смешением растворов полисахарида и ПСС-аниона в нейтральных средах, а полученные таким образом растворимые НПЭК отличались повышенной устойчивостью. Результаты работы свидетельствуют о перспективности применения модифицированного хитозана в качестве основного компонента физиологически активных, растворимых, биосовместимых и биодеградируемых комплексов, пригодных для использования в широком интервале изменения внешних условий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

физического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Полианионами служили фракции полисти-ролсульфоната натрия фирмы "Du Pont" (Франция

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком