ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2011, том 53, № 8, с. 1384-1393
ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТЫ
УДК 541.64:539.199
ВОДОРАСТВОРИМЫЙ АРОМАТИЧЕСКИЙ ДЕНДРИМЕР КАК МОДЕЛЬНАЯ ОСНОВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА
ДВОЙНОГО ДЕЙСТВИЯ1 © 2011 г. М. В. Жирякова*, Н. В. Кучкина**, З. Б. Шифрина**, В. А. Изумрудов*
* Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Химический факультет 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3 ** Учреждение Российской академии наук Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН 119991 Москва, ул. Вавилова, 28 Поступила в редакцию 14.01.2011 г.
Принята в печать 17.03.2011 г.
Методом тушения флуоресценции изучено сродство двух анионных пиренильных зондов к пириди-ниевым высокомолекулярным катионам различной топологии — поли-М-этил-4-винилпиридиний бромиду и водорастворимому полипиридилфениленовому дендримеру. Гидрофильный зонд, несущий три сульфонатные группы в молекуле, эффективнее взаимодействует с гибким высокозаряженным линейным поликатионом во всем изученном диапазоне рН. Связывание дендримера с относительно гидрофобным зондом, содержащим одну карбоксильную группу, усиливается с подкис-лением растворов и становится доминирующим в слабо кислых средах. Взаимодействие ДНК с дендримером, содержащим гидрофобный зонд, не влияет на образование дендриплекса и приводит к вытеснению лишь небольшой доли связанного зонда в раствор. Проведенные модельные исследования демонстрируют принципиальную возможность создания дендримерных носителей двойного действия, способных одновременно доставлять генетический материал и гидрофобные лекарственные средства в клетки-мишени.
ВВЕДЕНИЕ
Способность представителей некоторых семейств дендримеров растворяться в водных и водно-солевых средах и формировать полиэлектролитные комплексы с физиологически активными веществами привлекает к ним внимание биохимиков и молекулярных биологов. С помощью наиболее изученных водорастворимых дендриме-ров удается значительно повысить эффективность транспорта (трансфекцию) целевых нуклеиновых кислот в ядра клеток-мишеней [1—9], а наличие коммерчески доступных препаратов дендримеров делает возможной доставку генетического материала в опытах in vitro. В литературе имеются многочисленные публикации по денд-римерам как потенциальным носителям для доставки биологического материала (см., например, обзорную статью [3]).
Тем не менее некоторые ключевые моменты биологического действия, которое определяется поведением дендримеров внутри клетки, остают-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 07-03-00220 и 07-03-00228).
E-mail: izumrud@genebee.msu.ru (Изумрудов Владимир Алексеевич).
ся невыясненными, что является серьезным препятствием на пути создания эффективных и нетоксичных лекарственных веществ. Разработка дендримерных векторов, пригодных для использования в генной терапии, требует фундаментального изучения продуктов взаимодействия растворимых катионных дендримеров с нуклеиновыми кислотами (так называемых дендриплексов) и модельными синтетическими полианионами. Публикации такого рода [10—17] затрагивают комплексообразование ДНК с представителями одного и того же семейства растворимых алифатических дендримеров. Отсутствие возможности направленно изменять гидрофильно-липофиль-ный баланс, число заряженных групп, их относительное содержание и расположение в молекуле выбранной генерации существенно снижает ценность подобных дендримеров для модельных исследований.
Активного продвижения в указанной области удалось достичь с помощью катионных водорастворимых полипиридилфениленовых дендриме-ров (ППФД) [18—20]. Высокая упорядоченность трехмерной структуры этих жестких ароматических дендримеров, которая не вырождается при переходе к старшим генерациям, определяет фиксированное пространственное расположение
функциональных групп. Топологию заряженных групп можно задавать условиями синтеза и выбором исходных мономерных блоков, что позволяет реализовать различные варианты от равномерного распределения групп по молекуле до ярко выраженной локализации в ядре или на периферии дендримера [21]. Использование кати-онных водорастворимых ППФД сделало возможным исследование влияния таких фундаментальных характеристик дендримеров, как число положительных зарядов, их плотность, пространственное расположение и гидрофильно-липофильный баланс молекул, на связывание с полианионами в водных и водно-солевых средах.
Отличительной чертой жестких катионных ППФД, несущих в молекуле значительное количество гидрофобных фениленовых групп, является недоступность для взаимодействия с высокомолекулярными анионами большого числа пиридиниевых катионов, расположенных во внутренней сфере дендримера. Знаменательно, что для олигомерных метакрилатных анионов, содержащих в молекуле не более десяти зарядов, количество недоступных пиридиниевых катионов заметно снижается, а относительно гидрофобные стиролсульфонатные олигомерные анионы вообще не испытывают стерических затруднений, образуя с дендримером все возможные ионные пары [22].
Из этих данных следуют два вывода, которые могут представлять интерес для практического использования. Во-первых, наличие в молекулах жестких катионных ППФД значительной доли положительных зарядов, не доступных для взаимодействия с ДНК, обусловливает склонность дендримеров образовывать растворимые дендриплексы [15]. Особую ценность представляют растворимые положительно заряженные дендриплексы, поскольку их связывание с отрицательно заряженной клеточной мембраной является необходимым условием осуществления трансфекции. Во-вторых, обнаруженная способность катионных ППФД участвовать в гидрофобных взаимодействиях и предотвращать направленную диффузию высокомолекулярных анионных (био)полимеров в свою внутреннюю сферу, оставаясь при этом полностью проницаемыми для относительно гидрофобных олигомер-ных анионов, может обеспечить доставку гидрофобных анионных лекарственных веществ.
Результаты модельных исследований, проведенных в данной работе с использованием кати-онного ППФД и двух различных пиренильных зондов, демонстрируют принципиальную возможность создания дендримерных носителей двойного действия, способных одновременно доставлять генетический материал и гидрофобные лекарственные средства в клетки-мишени.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Буферные соли HEPES и TRIS и препарат NaCl фирмы "Sigma" (США) использовали без дополнительной очистки. Во всех экспериментах растворителем служила бидистиллирован-ная вода.
Катионный краситель бромистый этидий (БЭ) фирмы "Sigma" (США) растворяли в воде и определяли концентрацию по поглощению света при длине волны 480 нм, полагая s480 = 5600 л/моль см [23].
Пиренмасляную кислоту (PyrCOOH) фирмы "Fluka" (Германия) растворяли в водном растворе сильного органического основания гидроксида тетраметиламмония (10-3 моль/л). Концентрация PyrCOOH, которую определяли спектрофотомет-рически (s342 = 50000 л/моль см), составила 1.5 х 10-4 моль/л. Приготовленный таким образом раствор PyrCOOH оставался прозрачным при рН > 6.5. Перед проведением экспериментов раствор разбавляли в 100 раз раствором буфера HEPES (рН 7.15) или TRIS (рН 9.0). Натриевую соль 8-изотиоцианатпирена-1, 3,6-трисульфокис-
лоты (Pyr(SO-)3) фирмы "Serva" (Германия) растворяли в воде и определяли концентрацию раствора спектрофотометрически (s400 = 50000 л/моль см).
Поскольку в молекуле Pyr(SO-)3 содержатся три сульфонатных группы, мольная концентрация отрицательно заряженных групп SO- в 3 раза превышала мольную концентрацию Pyr(SO-)3.
Водорастворимый катионный дендример D^4 (дендример третьей генерации, содержащий 54 заряженные группы) синтезировали из ППФД алкилированием пиридиновых групп диметил-сульфатом по методике [18]. Исходным неалки-лированным ППФД служил полипиридилфени-леновый дендример третьей генерации, содержащий в молекуле 40 фениленовых групп и 66 пиридильных остатков, который получали дивергентным синтезом [21]. Поскольку степень ал-килирования дендримера составила 82%, молекула D^4 содержала в среднем 40 гидрофобных фе-ниленовых групп, 12 пиридильных групп и 54 положительно заряженных пиридиниевых групп. В условиях опытов при рН 7.15 и 9.0 неал-килированные пиридильные остатки дендримера депротонированы и не участвуют в электростатическом взаимодействии.
Так как точное местонахождение пиридиние-вых катионов и пиридильных групп в молекуле
D3 не определено, представление о строении подобного дендримера можно составить на основании приведенной ниже структурной формулы ги-
потетического катионного дендримера третьей килирования всех пиридильных групп исходного генерации, изображенного в предположении ал- ППФД.
Поли-М-этил-4-винилпиридиниевый катион (ПЭП) получали алкилированием бромистым этилом фракции поли-4-винилпиридина степени полимеризации 100, как описано в работе [24]. Степень алкилирования, которую определяли из ИК-спектра образца по интенсивности полос по-
глощения пиридиниевых звеньев (V = 1640 см 1) и неалкилированных пиридиновых звеньев (V = = 1600 см-1) [25], превышала 92%.
Концентрацию растворов дендримера и ПЭП выражали в терминах мольной концентрации
[N^j кватернизованных (пиридиниевых) аминогрупп.
Натриевую соль ДНК из тимуса теленка (~10000 пар оснований) фирмы "Sigma" (США) применяли без дополнительной очистки. Концентрацию фосфатных групп [P] в растворах нуклеиновой кислоты определяли спектрофотомет-рически (в2б0 = 6500 л/моль см [26]).
Методы исследования
Интенсивность флуоресценции I измеряли на спектрофлуориметре "Jobin-Yvon-3CS" (Франция), снабженном термостатированной ячейкой, при постоянном перемешивании и температуре 25° С. Длина волн возбуждения/эмиссии составляла 535/595 нм, 342/397 нм и 400/500 нм соответственно в случае БЭ, PyrCOOH и Pyr(SO-)3. В экспериментах с нуклеиновой кислотой использовали комплекс ДНК • БЭ, который получали смешением растворов компонентов в отношении [P] : [БЭ] =4:1. Эксперименты проводили в 0.02 М буферных растворах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На начальном этапе работы следовало убедиться,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.