БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 73-79
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК: 577.32, 577.34, 577.29
ВОДО Р АСТВОР ИМЫЙ ПОЛИ САХАР ИД ИЗ Heliantnus tuberosus L.: РАДИОЗАЩИТНАЯ, КОЛОНИЕСТИМУЛИ РУЮЩАЯ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНО СТЬ
© 2015 г. Е.А. Генералов
Физический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Ленинские горы, 1/2
E-mail: generals1179@gmail.сот Поступила в p едакцию 11.11.14 г.
Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о наличии у полисахарида из Heliantnus tuberosus L. с молекулярной массой 1-2 МДа иммуномодулирующей активности, колониестимулирующих и радиозащитных свойств. Изучено влияние различных концентраций углевода на продукцию фактора некроза опухолей-а, интерлейкина-1в и интерлейкина-6. Обсуждается природа радиопротекторных свойств полисахарида: стимуляция роста колоний гемопоэтических стволовых клеток, прямое взаимодействие с продуктами ионизирующего излучения и стимуляция цитокиновых каскадов. Обсуждается возможность применения полисахарида в качестве р адиопротектора и колониестимулятора.
Ключевые слова: радиозащита, колониестимуляция, иммуномодуляция, цитокиновая активность, полисах арид.
Радиопротекторы - химические вещества, при введении в организм нивелирующие последствия воздействия ионизирующего излучения [1]. Необходимость использования первых радиопротекторов была обусловлена необходимостью применения источников ионизирующего излучения в пер вую очередь в военной сфер е, а после - в гражданской. Трагедии прошлого века (авария на Чернобыльской АЭС) и нынешнего (авария на Фукусиме), а также отсутствие эффективных методов защиты от ионизирующего излучения ставят перед исследователями задачу по поиску новых радиопротекторов для оборонных нужд и экстренных служб. К роме того, радиопр отекторы необходимы для повышения эффективности курсов лучевой терапии у онкологических больных. Некоторые очищенные полисахариды проявляли свойства радиопротекторов [2-4]. Такие же свойства были обнаружены и у Heliantnus tuberosus L. [5].
Было замечено, что экстрагированные и очищенные полисахариды растений оказывают ярко выраженное регенеративное, противовоспалительное, антиоксидантное, гепатопротекторное и противорадиационное воздействие, стимулируют процессы кроветворения, активируют функции
Сокращения: ФНО - фактор некроза опухолей, IL -интерлейкин, МПК - мононуклеары периферической крови, ЛПС - липополисахарид.
иммунной системы при введении в организм, как здоровых животных, так и животных с различными видами патологий, что свидетельствует о возможности использования полисахаридов в качестве радиопротекторов [6-8].
Вместе с тем полисахариды, воздействуя на гемопоэтические стволовые клетки, стимулируют гемопоэз у здоровых, анемичных и облученных животных в костном мозге и в селезенке, стимулируя миелоидный, эритроидный и лимфоид-ный ростки кроветворения, что приводит к увеличению эритробластных островков в облученном костном мозге и числа эритроцитов в крови [9,10]. С этим, помимо прямого взаимодействия с продуктами ионизирующего излучения полимеров и серы, содержащейся в них, связывают радиопротекторные свойства карбогидратов [11,12]. Цитокиновые каскады и иммуномодули-рующая активность также позволяют нивелировать последствия воздействия облучения [13-15]. Поиск наиболее эффективных р адиопротекторов среди полисахаридов продолжается, и данная работа посвящена изучению радиозащитной и иммуномодулирующей активности природного полисахарида из ИеНаШпш tuberosus Ь.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Растительный полисахарид был выделен, очищен и получен для исследования в лабора-
тории «Ltd. Pte. Polylab». Полисахарид имеет молекулярную массу в интервале 1-2 МДа и хорошо р астворим в воде.
Влияние на продукцию фактора некроза опухолей а (ФНО-а), интерлейкина-1Р (IL-1P) и интерлейкина-6 (IL-6) клетками человека и животных. Влияние на продукцию ФНО-а. Методом градиентного центрифугирования из периферической крови здоровых доноров выделяли мо-нонуклеар ные клетки, котор ые дважды отмывали забуференным фосфатами изотоническим раствором NaCl. Клетки ресуспендировали в ср еде RPMI 1640 (ICN, Великобритания) с добавлением 10% фетальной бычей сыворотки (Flow, Великобритания), 20 мкг/мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина и 2 мМ HEPES, 2,8-10-6 М 2-мер каптоэтанола. Суспензию мононуклеаров периферической кр ови (МПК) с концентрацией 106 клеток/мл и объемом 1,5 мл/лунка культивировали 12 ч в 24-луночной панели (Nune, Дания) при температуре 37°С с липополисаха-ридом (ЛПС) в концентрации 0,1 мкг/мл во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, или без липополисахарида. Влияние полисахарида на продукцию цитокинов исследовали в дозах 1, 3, 10, 30 и 100 мкг/мл.
По методу Pафа и Гилфорда [16] определяли активность ФНО в надосадочных жидкостях. При температуре 37°С инкубировали клетки L-929 концентрацией 3-105 клеток в лунке в 96-луночных планшетах со средой 199 на растворе Хенкса с 10% инактивированной сывороткой крупного рогатого скота до возникновения монослоя. Культуральную среду удаляли и вносили по 100 мкл двукратных серийных разведений исследуемых образцов надосадочной жидкости и 100 мкл свежей ср еды с актиномицином D (Sigma, США) в концентрации 2 мкг/лунка. Клетки инкубировали 18 ч в тех же условиях. Для учета выживших клеток в лунку панели заливали 0,2% раствор кристалл-виолетта (Sigma, США) в 2% этаноле на 15 мин, промывали проточной водой и высушивали. Оптическую плотность окрашенных клеток определяли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan (Великобритания) при длине волны 540 нм. В качестве стандарта были выбраны различные концентрации реком-бинантного ФНО-а человека. Для построения калибровочной кривой применяли метод экспоненциальной регрессии.
Определение активности IL-1. Определение содер жания IL-1 в супер натантах проводили с помощью IL-1-чувствительной мышиной линии T-клеток хелперов клона D10.G4.1. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, с добавлением 10% фетальной бычей сыворотки, 2 мМ
L-глутамина, 50 мМ 2-меркаптоэтанола и 10% мышиного ростового фактора - источника IL-2. Pостовой фактор получали из супернатанта культивированных спленоцитов мышей линии DBS/2J в ср еде RPMI 1640 с добавлением 1% фетальной бычей сыворотки в пр исутствии 1 мкг/мл конканавалина А. Кональбумин и облученные клетки селезенки самцов мышей линии СВА/2 (H-2k) (Sigma, США) использовали в качестве антигена и фидерных клеток соответственно .
Клетки D10.G4.1 использовали на 10-12-е сутки культивирования после добавления антигена и фидерных клеток, инкубировали в течение 65 ч в присутствии серийных р азведений (1:20 - 1:200) исследуемых надосадочных жидкостей в 96-лу-ночных плоскодонных планшетах (2-104 кл/мл) в ср еде RPMI 1640 с добавлением 5% фетальной бычей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 2,5 мкг/мл конканавалина А в 5% влажной атмосфере. За 4 ч до окончания культивирования в культуру вносили 40 кБк (1 мкКи) на лунку Н3-тимидина. Клетки переносили на стеклянные фильтры и оценивали интенсивность включения радиоактивной метки с помощью жидкостного сцинтилля-ционного спектрофотометра [17].
Определение активности IL-6. Определение содер жания IL-6 в супер натантах проводили с помощью IL-6-зависимой гетер огибридомы D6C8 [18]. С ерийные разведения надосадочных жидкостей и рекомбинантный IL-6 (код 89/45, NIBS^ Великобритания), в качестве стандарта, инкубировали в 96-луночных плоскодонных планшетах с клетками (5 - 104 клеток/лунка) в 200 мкл при 37°С. Клетки культивировали 48 ч в RPMI 1640, содержащей 5% диализованную сыворотку АВ группы кр ови человека. За 4 ч до окончания культивирования в культур у вносили 40 кБк (1 мкКи) на лунку [Н3]-тимидина. Клетки перено сили на стеклянные фильтр ы и оценивали интенсивность включения радиоактивной метки с помощью жидкостного сцин-тилляционного спектрофотометра [18].
Модель выживаемости гемопоэтических стволовых клеток. Опыты проводили на самцах мышей линии F 1(СВАхС57В1/6) с массой тела 20-22 г. Соединение вводили внутривенно за 1 и 3 ч до и через 1 и 24 ч после облучения соответственно, в дозе 10 мкг/животное. Лабораторных животных (пять групп по 12 животных) подвергали воздействию гамма-излучения (источник Со60) в дозе 600 рад на аппарате «Луч» при мощности дозы 52,63 рад/мин. Контрольной гр уппой служили только облученные животные. Через восемь суток проводили эвтаназию мышей путем введения раствора нем-бутала в р а счете 60 мг/кг внутрибрюшинно.
Таблица 1. Уровень продукции ФНО (пкг/мл) мононуклеарами периферической крови здоровых доноров после 12-часовой инкубации без добавления ЛПС
Номера доноров Дозы полисахарида, мкг/мл
Контроль 1 3 10 30 100
1 291 ± 26 971 ± 27* 958 ± 101* 1534 ±134* 1488 ± 37* 1107 ± 62*
2 27 ± 6 33 ± 5 61 ± 9* 128 ± 11* 40 ± 5 49 ± 10
3 5 ± 1 24 ± 6* 33 ± 12* 37 ± 12* 32 ± 12* 42 ± 11*
4 41 ±3 199 ± 69* 164 ± 33* 252 ± 41* 298 ± 17* 15 ± 2*
5 227 ± 21 752 ± 53* 784 ± 31* 973 ± 119* 995 ± 76* 388 ± 26*
6 152 ± 24 148 ± 15 72 ± 13* 86 ± 9* 811 ± 23* 3 ±1*
7 1012 ± 93 2287 ± 239* 2665 ± 217* 3719 ± 229* 3222 ±261* 3211 ± 297*
8 219 ± 6 249 ± 22 324 ± 30* 656 ± 58* 522 ±23* 417 ± 15*
9 19 ± 4 177 ± 83* 205 ± 31* 237 ± 34* 8 ±2* 4 ± 1*
Примечание. * р < 0,05 (по сравнению с контролем).
Таблица 2. Уровень продукции ФНО (пкг/мл) мононуклеарами периферической крови здоровых доноров после 12-часовой инкубации в присутствии ЛПС
Номера доноров Дозы полисахарида, мкг/мл
Контроль 1 3 10 30 100
1 191 ± 12 277 ± 43* 215 ± 15 265 ± 19* 274 ± 25* 314 ± 21*
2 29 ± 4 257 ± 34* 322 ± 37* 383 ± 25* 379 ± 25* 380 ± 25*
3 748 ± 42 228 ± 15* 600 ± 50* 678 ± 30 936 ± 158* 1177 ± 137*
4 149 ± 33 131 ± 18 155 ± 14 126 ± 12 201 ± 11 189 ± 25
5 23 ± 6 52 ± 12 36 ±5 62 ± 5* 35 ±5 26 ± 4
6 2072 ± 68 1861 ± 179 2045 ± 110 2523 ± 156 2038 ± 108 1391 ± 64*
7 52 ± 13 46 ± 11 39 ±9 56 ± 12 47 ±9 76 ± 13
8 31 ±8 271 ± 49* 428 ± 79* 298 ± 28* 451 ± 77* 183 ± 33*
9 416 ± 14 266 ± 29* 400 ± 23 866 ± 222* 575 ± 54* 475 ± 34
Примечание. * р < 0,05 (по сравнению с контролем).
После этого произ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.