УДК 541.138
ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОДЕПРЕССИВНОГО АГЕНТА АЗАТИОПРИНА НА СТЕКЛОУГЛЕРОДНОМ ЭЛЕКТРОДЕ, МОДИФИЦИРОВАННОМ КОМПОЗИТОМ ГРАФЕН-ХИТОЗАН
© 2015 г. З. Хатами, Ф. Жалали1
Университет Рази, Керманшах, Иран Поступила в редакцию 10.02.2014 г.
Одностадийным электроосаждением композита графен—хитозан модифицирован стеклоуглеродный электрод. Поверхность охарактеризовали различными методами; они подтвердили присутствие наноструктуры из графеновых листов. Модифицированный электрод оказался очень эффективным для анализа на азатиоприн методом квадратно-волновой вольтамперометрии. Обратимость окислительно-восстановительной пары азатиоприна на нем значительно улучшается по сравнению с электродом с чистой поверхностью. Электродная функция линейна в интервале концентраций от 1.0 х 10-7 до
2.6 х 10-5 M, с чувствительностью 5.54 А/М; наименьшая определяемая концентрация равняется
4.7 х 10-8 М. Предложенный сенсор отличается высокой воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение 5%), повторяемостью (относительное стандартное отклонение 3.5%) и стабильностью при долговременном хранении. Модифицированный электрод успешно применялся для точного определения азатиоприна в фармацевтических препаратах и образцах сыворотки крови.
Ключевые слова: азатиоприн, сыворотка крови, хитозан, электроосаждение, графен
Б01: 10.7868/80424857015010090
ВВЕДЕНИЕ
Графен — совершенный двумерный углеродный материал — привлек большое внимание со времен первого о нем сообщения [1]. Для него характерны большое отношение поверхность/объем, высокая электропроводность и хорошая биосовместимость. Благодаря своей высокой чистоте (в отличие от нанотрубок, графен, получаемый восстановлением оксида графена, не содержит переходных металлов, Бе, N1 и т.п.), графен является хорошей основой для исследования электрокаталитического эффекта на углеродных материалах. Ожидается, что графен постепенно составит все большую конкуренцию углеродным нано-трубкам в различных применениях [2]. Широко изучаются методы синтеза графена и преимущества его применения в различных областях [3—5].
Хитозан — ^деацетилированное производное хитина — используется в качестве матрицы для иммобилизации в сенсорах и биосенсорах [6—9] благодаря своей высокой способности к пленко-образованию, биосовместимости, отсутствию токсичности, высокой механической прочности,
1 Адрес автора для переписки: fjalali@razi.ac.ir; 1аЫше1у'а1а-1i@yahoo.com (Б. Ja1a1i).
дешевизне и восприимчивости к химической модификации [10]. Хитозан широко используется для диспергирования наноматериалов и может создавать хорошее биосовместимое микроокружение в сенсорных структурах.
До настоящего времени пленки графена наносили на электроды главным образом методом наливания капли суспензии химически восстановленного оксида графена [11]. Полученные таким образом пленки весьма неоднородны по толщине, которую нелегко контролировать, так что изготовленные сенсоры не воспроизводимы. Недавно сообщалось, что нанолисты графена можно наносить на стеклоуглерод электроосаждением путем восстановления оксида графена в режиме циклической вольтамперометрии; потенциал электровосстановления оксида графена составляет около —1.0 В, причем полученные графено-вые пленки очень устойчивы [12].
Азатиоприн, 6-(1-метил-4-нитроимидазол-5-илтио)-пурин (см. схему), обычно используется главным образом в качестве иммунодепрессивно-го агента в методах аллотрансплантации [13]. Он также применяется в соматических противовоспалительных процедурах в связи с ревматоидным артритом, системной красной волчанкой и болез-
6
81
45 40 h 35
о
s я
се
м
о ^
С
о
ft 20
30 -25 -
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Волновое число, см-1
Рис. 1. ИК-спектр с преобразованием Фурье приготовленного оксида графена.
нью Крона [14-17]. Однако, его применение ограничено из-за природной высокой токсичности [18, 19]. Побочное действие азатиоприна может включать тошноту, усталость, облысение и сыпь. Вследствие угнетающего влияния азатиоприна на костный мозг пациенты могут стать более восприимчивыми к инфекциям.
N^2
< X
I
НзС n^V-N
Схема. Молекулярная структура азатиоприна.
Для определения азатиоприна в общей воде организма применялся ряд аналитических методов, таких как спектрофотометрия [20, 21], жидкостная хроматография высокого разрешения [22, 23], титрование [24] и 1Н-ЯМР [25]. Однако, у этих методов есть ряд недостатков, таких как дороговизна, большая продолжительность анализов, низкая чувствительность и избирательность, а также большая трудоемкость процесса подготовки образцов. Электрохимические методы демонстрируют заметные преимущества в анализе лекарств, фармацевтических препаратов и содержания жидкости в организме [26, 27]. В случае анализа на азатиоприн применялись модифицированные электроды: стеклоуглеродный электрод, модифицированный наночастицами углерода и пленкой нафиона [28] и композитом нано-алмаз-графит в матрице из хитозана [29].
В настоящей работе для изготовления сенсора на азатиоприн было использовано одностадийное электроосаждение композита графен-хито-зан на стеклоуглеродный электрод. Благодаря сочетанию преимуществ графена и хитозана нам
удалось получить пленку графен—хитозан, которая хорошо адсорбирует азатиоприн. Приготовленный модифицированный электрод успешно применялся для вольтамперометрического определения следовых количеств азатиоприна в фармацевтических препаратах и образцах сыворотки крови.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Реактивы и растворы
Порошок азатиоприна был получен в дар от фармацевтической компании Mehrdaru (Тегеран, Иран). Графитовый порошок (400 частиц на 1 дюйм) и хитозан (с низким молекулярным весом) были приобретены у компании Sigma—Aldrich (Сен-Луи, США) и использовались без дальнейшей очистки. Исходный раствор азатиоприна (0.01 М) готовили ежедневно на фосфатном буферном растворе (0.1 М, рН 7). Все остальные реактивы имели квалификацию "ч. д. а." и использовались без дополнительной очистки. Таблетки азатиоприна были приобретены у компании Ramopharmin Pharmaceutical Company (Тегеран, Иран). Образцы сыворотки крови здоровых людей были получены в больнице Imam Reza (Керманшах, Иран).
Оксид графена готовили по модифицированной методике Хаммерса [30], исходя из порошка графита. Вкратце, 3 г графита добавляли к раствору серной кислоты (360 мл) и фосфорной кислоты (40 мл) при перемешивании магнитной мешалкой. Затем к смеси медленно при помешивании добавляли перманганат калия (18 г). На следующей стадии к смеси прибавляли раствор Н2О2 в ледяной бане. Цвет смеси изменился на ярко-желтый, что указывает на высокую степень окисления графита. Раствор фильтровали, осадок промывали несколько раз водой для удаления оставшихся загрязнений. Процесс промывания проводили путем декантации маточного раствора с помощью центрифугирования (скорость 5000 об/мин) в течение 30 мин, что завершилось образованием оксида графена. Полученный оксид графена сушили при 60°С в течение 24 ч.
ИК-спектры с преобразованием Фурье продукта (рис. 1) подтвердили синтез оксида графе-на. Для идентификации оксида графена использованы следующие полосы [31]: O—H (3423 см-1); C=O (1735 см-1); C=C в ароматическом кольце (1624 см-1); C-OH (1229 см-1); C-O (1092 см-1).
Приборы
Электрохимические измерения проводили на потенциостате/гальваностате ц-Autolab type III, управляемом персональным компьютером. Накопление электрохимических данных вели с помощью программного обеспечения NOVA 1.8. Все
вольтамперограммы получены в трехэлектродной системе, включающей насыщенный каломельный электрод сравнения (нас. к. э.), платиновую проволочку — противоэлектрод и рабочий стек-лоуглеродный электрод (немодифицированный или модифицированный). Величину рН растворов измеряли рН-метром Jenway, модель 140, со стеклянным электродом с двойным жидкостным переходом. Все вольтамперометрические исследования были проведены в 0.1 М фосфатном буферном растворе.
Приготовление стеклоуглеродного электрода, модифицированного графеном—хитозаном
Стеклоуглеродный электрод тщательно полировали порошком оксида алюминия с различным размером частиц (1.0, 0.3 и 0.05 мкм) до зеркального блеска, а затем промывали дистиллированной водой для удаления оставшихся частиц. Оксид графена (5 мг) диспергировали в растворе хи-тозана (0.2 вес. %, 5 мл) в ультразвуковом поле. Полированный стеклоуглеродный электрод погружали в раствор оксида графена и хитозана при помешивании, прикладывая постоянный потенциал — 1.0 В в течение 400 с [12]. Приготовленный таким образом стеклоуглеродный электрод, модифицированный графеном—хитозаном, хранили при температуре 4°С в холодильнике.
Методика измерений
Азатиоприн накапливали на поверхности стек-лоуглеродного электрода, модифицированного гра-феном—хитозаном, погрузив электрод при потенциале разомкнутой цепи на 120 с в 0.1 М фосфатный буферный раствор (рН 7, 5 мл), содержащий азатиоприн. Электрод вынимали из раствора аза-тиоприна и промывали буферным раствором. Затем его переносили в ячейку, заполненную тем же буферным раствором, для электрохимического определения адсорбированного вещества. После каждого измерения поверхность электрода очищали путем анодного удаления адсорбата поляризацией при +0.5 В в течение 180 с в 5 мл перемешиваемого 0.1 М фосфатного буферного раствора (рН 7) [12].
Приготовление реальных образцов
Пять таблеток азатиоприна (50 мг в одной таблетке) полностью измельчали и порошок гомогенизировали. Затем 28 мг порошка точно взвешивали и растворяли в 0.1 М фосфатном буферном растворе (рН 7) при ультразвуковом облучении. Полученный раствор после фильтрования разбавляли до 100 мл и 50 мкл его добавляли к 5 мл фосфатного буферного раствора (рН 7).
Рис. 2. 8ЕМ-микрофотографии поверхности стекло-углеродного электрода: (а) немодифицированного и (б) модифицированного графеном—хитозаном.
Образцы сыворотки крови центрифугировали, фильтровали и разбавляли (в 10 раз) 0.1 М фосфатным буферным раствором (рН 7). В разбавленную сыворотку крови вводили следовые количества азатиоприна с использованием шприца.
Для определения азатиоприна
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.