УДК 577.151.6:577.24
ВОССТАНОВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЫ ПРИ ВКЛЮЧЕНИИ В РАЦИОН СТАРЫХ КРЫС ГИДРОГЕНИЗИРОВАННОГО АРАХИСОВОГО МАСЛА
© 2010 г. Г.Е. Бронников1*, Т.П. Кулагина1, А.В. Ариповский2
1 Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3; факс: (496)733-0509, электронная почта: gennadyJbronnikov@rambler.ru 2 ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, 142279 Оболенск Московской обл.
Поступила в редакцию 16.06.10 После доработки 13.07.10
Исследовано влияние гидрогенизированного арахисового масла, включенного в рацион старых крыс, на активность дыхательных ферментов митохондрий скелетной мускулатуры. В гомогенате скелетных мышц смешанного типа методом спектрофотометрии определены активности МАВН-коэнзимР1-оксидоредукта-зы, цитохром-с-оксидазы и цитратсинтазы. Показано, что активность дыхательных комплексов I и IV в мышцах старых крыс существенно понижалась с возрастом по сравнению с активностью этих же ферментов у молодых особей; активность цитратсинтазы оставалась практически неизменной. Жирнокислотный состав гомогената мышечной ткани старых крыс отличался от состава гомогената молодых животных пониженным содержанием миристиновой, олеиновой, линолевой и а-линоленовой кислот. При этом увеличивалась доля дигомо-у-линоленовой, арахидоновой и докозагексаеновой кислот. Введение в рацион гидрогенизированного арахисового масла полностью восстанавливало активность комплекса IV в мышцах старых крыс, а активность комплекса I достоверно возрастала до 80% от таковой в мышцах молодых особей. При этом понижалось содержание стеариновой, дигомо-у-линоленовой, арахидоновой, эйкозапентаеновой, до-козапентаеновой и докозагексаеновой кислот как по отношению к молодым, так и старым животным. Содержание олеиновой и линолевой кислоты увеличивалось не только по отношению к старым крысам, но и молодым животным. Обсуждаются возможные механизмы восстановления активности дыхательных ферментов под влиянием гидрогенизированного арахисового масла.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: дыхательная цепь митохондрий, окислительный стресс, старение, жирнокислотный состав липидов, скелетные мышцы, растительное масло.
Вопросы продления жизни и улучшения ее качества в пожилом и/или старческом возрасте издревле волновали людей. Восстановление активности ферментов дыхательной цепи митохондрий является актуальной проблемой, поскольку нарушение нормального функционирования митохондрий обнаружено как при ряде нейро-логических заболеваний [1], так и собственно в процессе старения [2]. Высказанная более 50 лет назад гипотеза «окислительного стресса» как основной причины повреждения клеток и тканей организма, в настоящее время является главен-
Принятые сокращения: АФК — активные формы кислорода; НМБ — 4-гидрокси-2-ноненал, ненасыщенный альдегид.
* Адресат для корреспонденции.
ствующей в объяснении возрастных изменений [3]. АФК, образующиеся преимущественно в митохондриях, являются основным повреждающим фактором последних [4]. Резкое увеличение продукции АФК в случае высокого трансмембранного потенциала в митохондриях [5] приводит к повреждению белков, липидов и митохо-ндриальной ДНК, что, в конечном счете, приводит к снижению активности дыхательных ферментов. Тотальное применение антиоксидантов для защиты тканей невозможно, так как в норме АФК выполняют важную роль как в клеточной, так и во внутримитохондриальной сигнализации [6, 7]. Механизмы образования активных форм кислорода в митохондриях и защита от них являются предметом интенсивного исследования. Поиск соединений, способных защи-
1720
щать митохондрии от повреждения АФК [5, 8], имеет не только практическое значение, но и способствует пониманию механизмов их избыточного образования.
Состояние электрон-транспортной цепи митохондрий при введении в рацион грызунов растительных масел, основу которых составляют жирные кислоты, изучается последних два десятилетия [9—15]. Недавно показано, что свободные жирные кислоты способны как снижать, так и увеличивать скорость образования АФК в митохондриях [10, 11]. Жирнокислотный состав фосфолипидов митохондриальных мембран влияет на активность мембранно-связанных ферментов и может быть модифицирован введением в рацион животным как отдельных жирных кислот, так и растительных масел [12—15]. Целью данной работы являлось исследование влияния гидрогенизированного арахисового масла, добавляемого в рацион старых животных, на активность ферментов дыхательной цепи митохондрий скелетных мышц.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Подготовка животных. В экспериментах были использованы крысы линии 8ргадие Dawley, содержавшиеся в виварии в индивидуальных клетках при естественной продолжительности светового дня. Животные находились на стандартном пищевом рационе (полнорационный комбикорм, рецепт ПК-120) при свободном доступе к пище и воде. Возраст животных был в пределах 26—33 месяца. На протяжении шести недель крысы ежедневно получали 0,5—0,7 мл гидрогени-зированного арахисового масла (<^1ика»), добавленного в небольшое количество овсяных хлопьев, заваренных горячей водой. Жирнокис-лотный состав масла представлен в табл. 1. Контрольные старые животные получали аналогичную порцию овсяных хлопьев без масла. Молодые контрольные крысы имели возраст 5—6 месяцев. Непосредственно перед опытом животных забивали в соответствии с международными протоколами методом декапитации с предварительной анестезией в атмосфере СО2.
Подготовка препаратов. После декапитации у животных брали ~50 мг ткани четырехглавой мышцы бедра, немедленно гомогенизировали в присутствии коктейля ингибиторов протеаз (10 мкл на 1 мл гомогената) во льду в стеклянном гомогенизаторе в 10 мМ фосфатном буфере, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,4. Гомогенат ткани фильтровали через капроновую ткань. Суспензию дополнительно обрабатывали ультразвуком (по 20—30 с 4 раза на половине мощности ультразвукового дез-
интегратора УЗДН-1). Для сравнительного анализа активности дыхательных комплексов в го-могенате и изолированных митохондриях из четырехглавой мышцы бедра крыс выделяли митохондрии в среде состава: 120 мМ KCl, 20 мМ HEPES, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ATP, 2 мг БСА/мл буфера, рН 7,4. Мышечную ткань (~2—3 г) тщательно измельчали ножницами, добавляли 10 мл буфера с 3—5 мг нагарзы, инкубировали 5 мин при 3°, после чего добавляли 10—20 мл холодного буфера, затем измельченную ткань либо фильтровали через капроновую ткань, либо осаждали центрифугированием. Далее выделение митохондрий проводили по традиционной методике: ткань гомогенизировали с 15 мл буфера в стеклянном гомогенизаторе, митохондрии осаждали, суспендировали в буфере, содержащем 250 мМ сахарозы, 2 мМ HEPES, 0,2 мМ ЭГТА, pH 7,4, и вновь переосаждали. Очистку митохондрий в градиенте плотности проводили по протоколу, прилагаемому к Percoll. Концентрацию белка в гомогенате и митохондриях определяли по методу Лоури, активность ферментов пересчитывали на 1 мг белка.
Определение активности ферментов проводили с использованием описанных ранее методик с незначительными изменениями [16—19]. Выбор методов проводили на основе сравнения их в экспериментах. Отличия от традиционных ме-
Таблица 1. Жирнокислотный состав гидрогенизированного арахисового масла
Жирные кислоты Содержание, %
Пальмитиновая (С16:0) 8,5
Стеариновая (С18:0) 16,8
Олеиновая (С18:1) 67,2
Линолевая (С18:2) 0,27
а-линоленовая (С18:3) 0,2
Арахиновая (С20:0) 1,55
Бегеновая (С22:0) 2,54
Лигноцероновая (С24:0) 1,42
Сумма насыщенных жирных кислот 31,02
Сумма мононенасыщенных жирных кислот 68,3
Сумма полиненасыщенных жирных кислот 0,47
тодов кажутся незначительными, но простая замена буфера 50 мМ KCl, 10 мМ Tris HCl pH 7,4 [18] на 10 мМ фосфатный буфер pH 7,4 0,1 мМ ЭДТА при гомогенизации мышечной ткани позволила сохранить активность комплекса I в го-могенате, а использование высокой концентрации восстановленного цитохрома с (50 мкМ и выше) позволило точнее определять активность комплекса IV [19]. Реакции инициировали добавлением аликвоты гомогената в 1 мл кювету при 30° и прописывали кинетику в течение 5—8 мин. Активность МЛБН-коэнзим-р1-оксидоредук-тазы определяли после 10 мин преинкубации гомогената при комнатной температуре с 30—50 мкМ NADH [20]. Об активности комплекса I судили по скорости переноса электрона с NADH на CoQ1, регистрируемой при 340 нм в отсутствие или присутствии ротенона. Запись кинетики цитратсинтазы регистрировали при 412 нм, отслеживая высвобождение СоА с последующим взаимодействием его с реагентом Эллмана. Активность комплекса IV определяли при 550 нм по скорости окисления цитохрома с. Для комплексов I и IV также проверяли их чувствительность к специфическим ингибиторам ротенону и цианиду, которая составила ~70—90 и 97—99% соответственно. Все реактивы, использованные при спектрофотометрическом определении активности митохондриальных ферментов, приобретены у фирмы («Sigma», ФРГ). Спектрофотометр Specord М-40 («Carl Zeiss») был существенно реконструирован с целью получения данных в электронном виде, а также для примерно 10-кратного повышения его чувствительности и стабильности. Данные на спектрофотометре сохраняли в виде ^txt-файлов, которые для всех дальнейших расчетов импортировали в Kaleida-Graph, версия 4.
Определение жирнокислотного состава гомогената мышечной ткани. В буфер для гомогенизации дополнительно добавляли 0,5% ионола (2,6-ди-трет-4-метилфенол). Гомогенат из 50 мг мышечной ткани высушивали в ротационно-ва-куумном концентраторе Savant SpeedVac («Savant Instruments», США). Метиловые эфиры высших жирных кислот получали по методу, описанному ранее [21]. Для определения жирных кислот использовали аналитический газовый хроматограф GC 3900 («Varian», США) с пламенно-ионизационным детектором (температура — 260°). Метиловые эфиры жирных кислот разделяли на кварцевой капиллярной колонке (15 м х 0,25 мм х х 0,3 мкм) с привитой неподвижной фазой SUPELC0WAX-10 («Supelco», Швейцария). Ввод пробы (2 мкл) осуществляли без деления потока газа-носителя (гелий), переход к режиму деления проводили через 12—30 с в зависимости
от концентра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.