= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 538.9: 577.352.332/.335: 577.175.5: 577.31
ВОЗДЕЙ СТВИЕ АНДР ОГЕНОВ НА АКТИВНО СТЬ Na+ ,К+ -АТФазы
ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН
© 2014 г. Л.Е. Панин, П.В. Мокрушников
Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт биох имии
СО РАМН, 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Поступила в р едакцию 25.06.12 г.
После последней доработки 07.10.13 г.
И сследовалоно воздействие андрогенов (тестостерона, андростерона, дегидроэпиандростерона и дегидроэпиандростеронсульфата) на эритроцитарную мембрану при их неспецифическом связывании. Измерялось изменение активности ^+,К+-АТФазы эритроцитарных мембран при разных концентрациях гормонов во взвеси. Показано, что зависимость носит куполообразный характер: при увеличении концентрации гормона активность фермента сначала увеличивалась, затем достигала максимума, а в дальнейшем уменьшалась. Ранее было установлено, что при нагружении биомембран андрогенами происходит увеличение их микровязкости с выходом на плато в области насыщения. П редполагается, что повышение активности ^+,К+-АТФазы связано с увеличением максимальной энергии квантов колебательного движения атомов биомембраны (фононов), что облегчает конформационные изменения в ферменте, сообщая его субъединицам дополнительную энергию. Дальнейшее увеличение микровязкости мембраны приводит к затруднениям деформирования липидного бислоя при конформационных переходах фермента, что снижает его активность.
Ключевые слова: плазматические мембраны, гормоны, структурные переходы, активность Nа+,К+-А ТФазы мембраны эритроцита.
Ка+,К+-АТФаза плазматических мембран является фер ментом, поддерживающим на ней необходимый электрохимический потенциал. За счет энергии, получаемой пр и гидролизе АТФ, фер мент переб ра сывает ионы Ка+ пр отив сил электро статического поля на внешнюю поверхность клетки. Это необходимо для поддер жания электрической возбудимости нервных и мышечных волокон, транспорта молекул через мембрану, самого существования клеток. В много -численных работах было исследовано влияние различных фактор ов (концентрация ионов, изменение температуры, рН) на активность Ка+,К+-АТФазы. Изучено также влияние на нее состояния фосфолипидного бислоя [1-6]. Установлено, что Ка+,К+-АТФаза является ли-пид-зависимым ферментом [1,6]. Ее активность, так же как и транспортные функции, зависят от липидного микроокружения, в том числе и от его агрегатного состояния. Считается, что при удалении липидов необратимо нарушается третичная и четвер тичная структура этого фермента [6].
Сокращения: ДЭА - дегидроэпиандростерон, ДЭАС -дегидр оэпиандр о стер онсульфат.
В настоящее вр емя стало известно, что ан-дрогены могут усиливать экспрессию генов Ка+,К+-АТФазы [7] и непосредственно влиять на ее активность [8,9]. Показан бифазный эффект тестостерона на активность Ка+,К+-АТФ-азы мозга: в низких дозах гормон стимулировал ее активность, а в средних и высоких - инги-бировал [8]. В работах [2-5] обнаружено как увеличение, так и уменьшение активности фермента в зависимости от содержания фосфоли-пидов и холестерина в биомембране. Полученные результаты авторы объясняли изменением гидрофобных взаимодействий Ка+,К+-АТФаз с окружающими их фосфолипидами. Однако механизм этого влияния они не раскрыли. Нам представляется, что лишь достаточно широкий физико-химический анализ поведения эритро-цитарных мембран позволяет раскрыть связь изменения их структур ы и функции. Нормальная активность этого фермента чрезвычайно важна для выполнения одной из основных функций эритроцита - трансмембранного переноса кислорода.
В настоящее время большой интерес к мужским половым гормонам (андрогенам) объясняется их широким использованием в спортивной медицине и тренерской работе. В связи с выраженным анаболическим действием этих
гор монов удается добиваться высоких спортивных результатов. П р и этом побочные негативные эффекты во внимание не принимаются. С амым тяжелым последствием их избыточного применения является развитие сер дечной недостаточности, которая может пр ивести к смерти спортсмена прямо во вр емя соревнований [10].
В данной работе изучалось изменение активности Ка+,К+-АТФазы эритроцитарных мембран пр и разных концентр ациях таких анаболиков, как тестостерон, андростерон, дегид-роэпиандростерон (ДЭА) и дегидроэпиандро-стеронсульфат (ДЭАС) в инкубационной ср еде с целью выявить индивидуальные особенности действия каждого гормона в отдельности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Измерение активности №+,К+-АТФазы.
Эритр оциты получали из свежевыделенной кро -ви после декапитации самцов крыс линии «""18-1аг» под легким нембуталовым наркозом. В опытах использовали животных массой 180— 200 г, возраст - три месяца. К ровь разбавляли в пять раз изотоническим 100 мМ трис-НС1 буфер ом (рН 7,35). После осаждения клеток с помощью центрифугирования при 330 g в течение 10 мин надосадочную жидкость сливали и процедуру промывки повторяли еще два раза.
Тени эритроцитов получали после гемолиза эритроцитов в гипотоническом 10 мМ трис-НС1 буфере (рН 7,35). Тени отмывали от избытка гемоглобина 30 мин центрифугированием при 3300 g, надосадочную жидкость удаляли. Про-цедуру повторяли шесть раз. Все операции про -водили при 4°С.
Концентрацию белков теней определяли методом Варбурга и Кристиана по изменению оптической плотности взвеси [11]. Определение активности Ка+,К+-АТФазы в мембране эритроцитов проводили методом [6,12], основанном на накоплении неор ганического фосфора (Р;) в ср еде, содержащей АТФ. П ринцип метода заключается в том, что в кислой среде молибде-новокислый аммоний и фосфорная кислота (и ее соли) после гидролиза АТФ ферментом вступают в р еакцию с образованием фосфомолиб-дата аммония. Восстановление последнего приводит к образованию смеси различных окислов молибдена, имеющих синюю окраску.
К 20 мкл суспензии мембран эритроцитов с концентрацией С = 20 мг белка/мл добавляли гор моны и 40 мкл инкубационной ср еды следующего состава (мМ): КаС1 - 125, КС1 - 25, ]^С12 - 3, ЭДТА - 5, АТФ - 2, трис-НС1 -50 (рН 7,35). Концентрация теней эритроцитов примерно соответствовала их концентрации в
крови. В качестве контроля в др угой пробирке к такому же со ставу добавляли 5 мкл растворенного в гипотоническом трис-HCl буфере уа -баина (MP Biomedkals, LLC) с концентрацией 10-2 М. Инкубацию проводили пр и 37°C в течение 1 ч. Реакцию останавливали 40 мкл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. Осажденный белок отделяли центрифугированием при 330 g в течение 15 мин. Для определения количества образовавшегося неорганического фосфор а (Р;) в каждую ячейку планшета к 40 мкл надосадочной жидкости добавляли 100 мкл молибденового реактива (2,5 г (NH4)6Mo7O2, 13 мл H2SO4 конц., 200 мл H2O дист.), 40 мкл 7% водного раствор а аскорбиновой кислоты. Через 20 мин измеряли разность поглощения при 630 и 495 нм на микропланшетном фотометре STAT FAX-2100 фирмы Awareness Тес-hnology 1пс. По калибровочным кривым вычисляли концентрацию неорганического фосфора в каждой пробе и рассчитывали ферментативную активность. За активность Na+,K+-АТФазы принимали разность между активностью фермента, измеренной без уабаина и с уабаином. Активность выражали в мкмоль/ч-мг белка. Уабаин является специфическим ингибитором активности ^+,К+-АТФазы, он не подавляет активности других АТФаз биомембраны, поэтому контроль показывает суммарную активность всех прочих АТФаз.
Ошибки измерения появлялись из-за погрешностей при объемном дозировании проб взвеси «теней» и титровании их гормонами. Относительные погрешности измерения величин поглощения были равны 3%, активности ^+,К+-АТФазы - 6%.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Были измерены зависимости активности ^+,К+-АТФазы мембраны эритр оцитов и про -чих АТФаз от концентрации гормонов во взвеси (рис. 1-4). В работе рассчитывали удельную концентрацию гормонов (концентр ация гормонов, деленная на концентрацию белков теней эритроцитов во взвеси). Показано, что активность фермента при увеличении концентрации гор монов вначале увеличивалась, а после достижения некоторого максимального значения начинала уменьшаться.
При воздействии андростерона максимум активности ^+,К+-АТФазы мембран эритро-цитов наблюдали при удельной концентрации 1,3-10-10 моль/мг белка, для тестостерона - при удельной концентрации 1,5-10-10 моль/мг белка (рис. 1в, 2в). Максимальное значение активности при воздействии андростерона оказалось в
20, а тестостер она - 18 р аз выше, чем пр и отсутствии гормона. Максимум активности фер мента наблюдали пр и удельной концентр а -ции ДЭАС 1,5-10-8 моль/мг белка, пр и этом активность увеличивалась в два раза (р ис. 3в). Влияние ДЭА на активность Ка+,К+-АТФазы не удало сь обнаружить.
На активность прочих АТФаз мембраны гормоны также влияли бифазно (рис. 1б, 2б, 3б, 4б). Андр о стер он увеличивал их активность на 10%, тестостер он - на 30%, ДЭАС - на 80%, ДЭА - на 25%. Максимумы их активности наступали раньше, чем максимумы активностей Ка+,К+-АТФазы.
Активность Ка+,К+-АТФазы мембр аны эритроцитов коррелировала с изменением их микровязкости при действии гормонов во взвеси [13]. На рис. 1а, 2а, 3а, 4а приведены результаты этих исследований. При нагружении мембр ан андр огенами конфор мационные изменения мембр анных белков сопр овождались увеличением микр овязкости мембр аны из-за усиления липид-липидных и белок-липидных взаимодействий в образовавшихся доменах. Мем-б р ана становилась более жесткой. Затр удняла сь латеральная диффузия, плотность мембраны возрастала. В условиях насыщения кривая относительной микр овязкости выходила на плато. Сильнее всего воздействовал на мембрану ан-др о стер он: отмечалось увеличение микр овязко-сти на 50% (рис. 1а), а увеличение активности фермента - в 20 раз (рис. 1в). Удельная концентр ация андр о стер она во взвеси, пр и котор ой микровязкость выходила на плато, очень мала (2,5-10-10 моль/мг белка). Тестостер он увеличи -вал микр овязкость мембр ан на 20%, а активность Ка+,К+-АТФазы - в 18 раз (рис. 2а,в). Максимум активности фермента наблюдали пр и концентр ации гор монов 3-10-10 моль/мг белка
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.