МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 758-762
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.8.043
ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЙ НА ПРОЯВЛЕНИЕ СТРЕССА У ОЛИГОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ
© 2004 г. О. И. Слабова, Д. И. Никитин
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 27.05.03 г.
Впервые установлена способность к росту при отрицательной температуре (-2°С) у представителей пяти родов психроактивных олиготрофных бактерий Агсоссе11а, ЯеиоЬааег, Бр1гозота, Саи1оЬааег, и МеШу1оЬаЛег1ит. Длительное культивирование в течение 116 сут при низкой температуре в условиях лимита источника углерода является стрессом для олиготрофных бактерий и приводит к частичной гибели клеток. Выживаемость Саи1оЬаШг с^сенШ падает на 2-3 порядка. ЯегюЬааег уасиоШит сохраняет жизнеспособность в исследуемый промежуток времени при низкой температуре, а при комнатной - голодный стресс вызывает снижение титра колониеобразующих клеток на 2 порядка.
Ключевые слова: олиготрофные бактерии, температура, голодание, стресс, выживаемость.
Медленнорастущие олиготрофные бактерии, широко распространенные в природных экосистемах и доминирующие в них, характеризуются повышенной устойчивостью к стрессорным факторам [1]. Они способны к росту при низких (6-8°С) температурах, некоторые предпочитают температуры 8-10°С. Психротолерантность установлена у многих почвенных форм олиготрофов при сохранении некоторого преимущества в росте при более высокой (28°С) температуре, особенно на средах с метанолом [2]. Олиготрофные бактерии с высоким содержанием лецитина в мембранах обладают повышенным уровнем адаптации к воздействию стрессовых факторов. Быстрый отклик на стрессорные воздействия, приводящий к защитной адаптации к ним клеток, проявляется в изменениях липидного профиля мембран и элементного гомеостаза клеток [3]. В литературе имеются сведения о корреляции физиологической и биохимической активностей психрофилов со специфичностью химической структуры клеточных мембран, что проявляется, в частности, в характере отклика микроорганизмов на температурные условия их культивирования. С повышением температуры культивирования у микроорганизмов снижалась активность дыхания, возникали повреждения и гибель клеток, изменялись текучесть и проницаемость мембран, менялось содержание и соотношение фосфолипидов, усиливался синтез РНК и снижался синтез белка [4]. Тем не менее, выживание бактерий в условиях отрицательных температур и длительного голодания остается недостаточно изученной проблемой [5, 6].
Целью настоящей работы явилось изучение характера роста и выживаемости представителей пяти родов психроактивных олиготрофных бак-
терий - Arcoccella, Renobacter, Spirosoma, Caulo-bacter, и Methylobacterium при отрицательных температурах и в условиях длительного воздействия низких температур при лимитации источников питания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы и условия их культивирования. Культуры бактерий Arcoccella aquatica NP-502 (коллекция ИНМИ), Renobacter vacuolatum (коллекция ИНМИ), Spirosoma linguale (коллекция ИНМИ), Caulobacter crescentus (ATTC 15252) поддерживали на среде ПДГ (пептон, дрожжевой экстракт, глюкоза - по 0.1%), культуру Methylobacterium organophylum NP-220 (коллекция ИНМИ) - на минеральной среде Хирша с 1% метанола [7].
Для исследования роста микроорганизмов при отрицательной температуре (-2°C) использовали среды ПДГ и Хирша с 1% глицерина. Культивирование бактерий проводили в жидкой среде в стационарных условиях без принудительной аэрации. Более высокие концентрации глицерина тормозили развитие культур. Контролем служило культивирование бактерий в тех же условиях при комнатной температуре. Культуры выращивали в чашках Петри, содержащих по 50 мл суспензии в течение 26 сут.
Для изучения степени выживаемости олиготрофов при лимите источников питания (стресс голодания) бактерии культивировали в 100-мл стеклянных флаконах, закрытых стерильными резиновыми пробками, на качалке (250 об/мин) при температурах 7 и 28°C в течение 116 сут на среде следующего состава: Na2HPO4 - 0.8 г, KH2PO - 0.2 г,
воздействие температурных условии
759
Таблица 1. Рост R. vacuolatum и C. crescentus в жидкой среде с глутаматом № при разных температурах (ед. оптической плотности)
Возраст культуры, сут
R. vacuolatum
C. crescentus
28
Температура инкубации, °C
7
28
Концентрация глутамата Na, мг/л
15 150 15 150 15 150 15 150
0 0.08 0.09 0.08 0.09 0.08 0.10 0.08 0.10
7 0.15 0.28 0.12 0.21 0.25 0.28 0.18 0.20
21 0.20 0.35 0.18 0.27 0.28 0.35 0.30 0.37
116 0.21 0.37 0.24 0.40 0.30 0.38 0.28 0.35
М§2Б04 • 7Н20 - 0.05 г, микроэлементы [7], глута-мат Ка - 15 или 150 мг на 1 л Н20 дист. Пробы для анализов отбирали шприцем через резиновую пробку по 2.0 мл на 7, 14, 21, 35 и 116 сут инкубации.
Определение роста культур. Рост бактерий определяли по изменению оптической плотности суспензий на спектрофотометре при X = 600 нм. Динамика роста микроорганизмов выражена в процентах прироста биомассы. Морфологию клеток при длительном культивировании контролировали в световом микроскопе с фазово-контрастным устройством.
Анализ газовой фазы. С02 определяли на газовом хроматографе ЛХМ8МД, детектор по теплопроводности, колонка 1.5 м х 3 мм, порапак О 80-100 меш, газ-носитель - водород, скорость протока 40 мл/мин, температура комнатная. Кислород определяли на том же приборе, детектор по теплопроводности, колонка 2.5 м х 3 мм, молекулярное сито 13 х 0.25 мм, газ-носитель - аргон, скорость протока 40 мл/мин, температура комнатная.
Выживаемость микроорганизмов после стрес-сорных воздействий определяли стандартным методом посева разведений клеточной суспензии на твердые питательные среды в чашках Петри.
Эксперименты проводили в двух последовательных опытах с тремя повторностями в каждом, результаты усреднены.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что все исследуемые культуры способны к росту при отрицательной температуре (-2°С), что согласуется с полученными ранее данными о росте олиготрофных бактерий при низких (7-8°С) температурах [3]. Кинетика роста изучаемых микроорганизмов при разных температурах представлена на рис. 1, 2. Установлено значительное угнетение роста у культур кспс)-bacter vacuolatum и Methylobacterium organophylum
(рис. 1а и 16). При микроскопировании лизиса клеток и образования сферопластов, свидетельствующих об отмирании бактерий, не наблюдали. Оптическая плотность суспензии Caulobacter crescentus через 2 нед. культивирования при температуре -2°С оказалась такой же, как и при комнатной и оставалась неизменной до конца опыта (рис. 1в). Характер роста Ärcocella aquatica и Spirosoma linguale, сходных по фосфолипидному профилю клеток и липидному комплексу мембран, оказался похожим (рис. 1г, 1д). Обе культуры при отрицательной температуре на 15-20-е сут выходили на стационарную фазу роста; показатели роста S. linguale достигали сопоставимых уровней оптической плотности при обеих температурах с некоторым отставанием развития при отрицательной температуре. При комнатной температуре на 3-ей нед. культивирования наблюдалось снижение оптической плотности, связанное с лизисом клеток (наблюдения в фазово-контрастном микроскопе за морфологическими изменениями клеток). Таким образом, отрицательные температуры, по-видимому, не являются для олиготрофных бактерий стрессовым фактором, чем объясняется их широкое распространение в природных экосистемах.
Развитие и выживаемость двух культур олиго-трофов, характеризующихся различным ростом при низких температурах, R. vacuolatum и C. crescentus, при длительном культивировании (116 сут) в условиях голодания, на средах, содержащих 15 и 150 мг/л глутамата № в качестве единственного источника углерода, отражены в табл. 1 и 2 и графиках (рис. 2а и 26).
Максимальный прирост биомассы и интенсивное выделение углекислоты отмечены в период с 7 по 21-е сут культивирования обеих бактерий в стрессовых условиях (дефицит углерода и низкая температура). В предыдущих исследованиях нами было показано, что олиготрофные бактерии способны использовать запасенные ранее внутри-
% ОП 5004003002001000 600
500 400 300 200 100
0 600 500 400 300 200 100
0
10
15
сут
20
25
% ОП 600
500
400
300
200
100
0
500 400 300 200 100
0
30
" +28
10
15
сут
20
25
30
Рис. 1. Кинетика роста олиготрофных бактерий при разных температурах (-2 и 28°C): а - R. vacuolatum; phylum NP-220; в - C. crescentus; г - A. aquatica; д - S. linguale.
- M. organo-
клеточные резервы - поли-Р-оксибутират [8]. Этим может быть объяснен медленный рост культур (табл. 1) и выделение С02 после исчерпания незначительных источников питания, присутствующих в культуральной жидкости (рис. 2а, 26).
Это предположение согласуется с результатами исследований поведения R. vacuolatum при полном исчерпании в среде и в клетках запасных питательных веществ [9]. Рост и дыхание обеих культур на среде с высоким уровнем источника угле-
5
5
ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЙ
761
рода (150 мг/л) достигали больших значений. Реакции на температурный фактор у этих бактерий несколько отличаются - рост и дыхание Я. уасио1а-гит при низкой температуре замедлены, а у С. сгез-сенгиз в обоих температурных условиях сходны.
Количество клеток (выживаемость) исследуемых бактерий после 116 сут культивирования отличалось от титра клеток, внесенных при посеве (табл. 2). Несмотря на сохранение значений оптической плотности и неизменной морфологии клеток (при микроскопировании сферопластов, разрушенных клеток и следов их гибели не наблюдалось), число колониеобразующих единиц (КОЕ) значительно уменьшилось. Выживаемость С. сгез-сенгиз понизилась в результате стресса на два порядка (табл. 2) при культивировании при комнатной температуре и на три порядка - при температуре 7°С. Клетки Я. уасиоШит значительно лучше переносили низкие температуры. В условиях замедленного метаболизма количество жизнеспособных клеток уменьшилось примерно вдвое (табл. 2). Так как при комнатной температуре все обменные процессы протекают значительно быстрее, бактерии гораздо раньше расходуют энергетические ре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.