НЕЙРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 2, с. 130-137
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.1:599.323.4
ВОЗДЕЙСТВИЕ ТИОКТОВОЙ КИСЛОТЫ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ГЛУТАТИОНОВОГО РЕДОКС-ЦИКЛА ПРИ РАЗВИТИИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС
© 2009 г. А. В. Макеева*, Т. Н. Попова
Воронежский государственный университет, Воронеж
Исследовано воздействие тиоктовой кислоты иа функционирование глутатионового редокс-цикла и активность некоторых НАДФН-генерирующих ферментов при развитии острой ишемии-репер-фузии головного мозга у крыс. Показано, что при введении тиоктовой кислоты животным с пости-шемической реперфузией происходило снижение активностей глутатионпероксидазы и глутатион-редуктазы, возрастающих при патологии. При этом содержание восстановленного глутатиона также приближалось к контрольным значениям. Кроме того, в условиях развития ишемии-реперфузии введение тиоктовой кислоты вызывало снижение активности НАДФ-зависимой изоцитратдегидро-геназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что, вероятно, связано с уменьшением необходимости поставки НАДФН для работы глутатионзависимого звена антирадикальной защиты. Таким образом, проведенные исследования показали, что тиоктовая кислота может выступать как фактор, регулирующий степень развития окислительного стресса и состояние глутатионовой антиоксидант-ной системы.
Ключевые слова: тиоктовая кислота, мозг, ишемия, реперфузия, антиоксиданты.
ВВЕДЕНИЕ
Одно из ведущих мест среди нарушений функционирования головного мозга принадлежит ишемии [1, 2]. Ишемический каскад, запускаемый гипоксией и лактат-ацидозом, приводит к интенсификации процессов свободнорадикального окисления (СРО), которые еще более усугубляются в период реоксигенации [3], оказывая при этом сильное повреждающее действие на организм [4]. Функционирующая в организме глутатио-новая антиоксидантная система (АОС) участвует в обезвреживании агрессивных форм кислорода и обеспечивает восстановление гидроперекисей в процессах пероксидного окисления липидов (ПОЛ) [5]. Известно, что в глутатионовый редокс-цикл входят глутатионпероксидаза (ГП, КФ 1.11.1.9) -фермент обладающий антиоксидантной активностью и использующий глутатион в качестве донора электронов, а также глутатионредуктаза (ГР, КФ 1.6.4.2) -катализирующая восстановление глутатиона из окисленной формы (088в) в восстановленную (в8Н) [6]. Для эффективной работы данной АОС необходимым условием является поставка восстановительных эквивалентов. Существенная роль в поддержании определенного уровня НАДФН в клетке принадлежит пентозо-фосфатному пути, ключевым ферментом которого является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49). В качестве альтернативно-
* Адресат для корреспонденции: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, тел.: (4732)208-278, факс: (4732)208-755; e-mail: makeeva81@mail.ru
го источника НАДФН может выступать реакция, катализируемая НАДФ-зависимой изоцитратде-гидрогеназой (НАДФ-ИДГ, КФ 1.1.1.42) [7]. Однако в условиях патологии действие эндогенных защитных механизмов бывает недостаточным, и поэтому в медицинской практике все чаще используются экзогенные антиоксидантные препараты. Перспективной в этом отношении, но недостаточно изученной, является тиоктовая кислота (ТК), функционирующая как кофактор в мульти-ферментных комплексах, катализирующих окислительное декарбоксилирование пирувата и а-ке-тоглутарата [8]. Антиоксидантный эффект ТК обусловлен наличием двух тиоловых групп в молекуле, а также способностью связывать радикалы и ионы металлов [9]. ТК не только обладает самостоятельным антиоксидантным потенциалом, но и обеспечивает мощную поддержку работы других антиоксидантных звеньев в организме. В этом отношении ее протекторное действие тесно связано с гомеостазом в системе глутатиона [10]. В связи с этим цель данной работы - исследование воздействия ТК на функционирование глутатионовой АОС и активность ферментов, осуществляющих поставку НАДФН для работы данной системы при развитии экспериментальной ишемии-реперфузии головного мозга у крыс.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования использовали самцов белых лабораторных крыс (ЯаПш тм-
Ь.) массой 150-200 г, содержащихся на стан-
дартном рационе питания в виварии. Индуцирование ишемии головного мозга у животных опытной группы осуществляли путем 30-минутной окклюзии обеих общих сонных артерий [11], реперфузия достигалась снятием окклюзоров, восстановление кровотока контролировали визуально. Спустя трое суток животные были умерщвлены под эфирным наркозом и головной мозг извлечен из полости черепа по стандартной методике. Извлеченный из полости черепа мозг замораживали в жидком азоте и гомогенизировали в трехкратном объеме охлажденной среды выделения (0.05 М Tris-HCl-буфер (рН 7.8), содержащий 1 мМ ЭДТА и 1% Р-меркаптоэтанола). Гомогенат центрифугировали при 7000 g в течение 10 мин. Забор крови осуществляли из сердца животного. Кровь помещали на 0.5 ч в термостат при 37°С, затем центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин. Сыворотку крови и гомогенат ткани головного мозга использовали для дальнейших исследований. Крысы были разделены на 6 экспериментальных групп: I группа (контроль) - лож-нооперированные животные; II группа -животные с постишемической реперфузией головного мозга; в III и IV группах ложноопериро-ванным животным вводили ТК внутрибрюшинно в виде суспензии в физиологическом растворе в дозах 35 и 70 мг/кг, один раз в сутки в течение 3 дней эксперимента; в V и VI группах животным с ишемией-реперфузией головного мозга вводили ТК также внутрибрюшинно в виде суспензии в физиологическом растворе в дозах 35 и 70 мг/кг, один раз в сутки в течение 3 дней эксперимента. Состояние энергетического обмена в ткани головного мозга оценивали по содержанию лактата и пирувата [12]. Активность ГП, ГР, Г6ФДГ и НАДФ-ИДГ определяли спектрофотометриче-ски при 340 нм [13]. За ферментативную единицу (Е) принимали количество фермента, катализирующее превращение микромоля субстрата или образование микромоля продукта за 1 мин при 25°С. Концентрацию GSH определяли с помощью реакции с 5.5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой [14]. Содержание общего белка оценивали по методу Лоури [15].
Полученные данные обрабатывали с использованием i-критерия Стьюдента, различия сравниваемых показателей считали достоверными при р < 0.05.
В ходе работы использовали изоцитрат ("Sigma"), НАДФН, Tris-На-буфер, ЭДТА ("Reanal", Венгрия), тиоктовую кислоту, GSSG и GSH ("ICN", Германия), остальные реактивы - отечественного производства марки "х.ч." или "ч.д.а.".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Показано, что окклюзия обеих общих сонных артерий с последующей реперфузией приводила к глубоким изменениям в метаболизме головного мозга крыс. Было выявлено значительное увели-
Влияние тиоктовой кислоты на содержание лактата и пирувата в контроле и при развитии ишемии-реперфузии головного мозга крыс
Группа животных Содержание лактата, мкМ/г Содержание пирувата, мкМ/г Соотношение лактат/пиру-ват
I 1.76 ± 0.07 0.170 ± 0.0068 10.35 ± 0.42
II 5.84 ± 0.23* 0.071 ± 0.0029* 82.25 ± 3.29*
III 1.72 ± 0.07 0.172 ± 0.0068 10.00 ± 0.40
IV 1.70 ± 0.07 0.175 ± 0.0069 9.71 ± 0.41
V 2.12 ± 0.08* 0.134 ± 0.0054* 15.82 ± 0.63*
VI 1.71 ± 0.07 0.176 ± 0.0069 9.72 ± 0.41
Примечание: * - отличия от контроля достоверны (уровень значимостир < 0.05).
чение содержания лактата - более чем в 3 раза, на фоне снижения содержания пирувата - почти в 3 раза. Отношение лактат/пируват, являющееся показателем интенсивности анаэробного глико-литического пути превращения углеводов, возрастало более чем в 8 раз, что свидетельствует о подавлении аэробного и усилении "аварийного" гликолитического механизма образования энергии. Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что перевязка сонных артерий у крыс приводит к выраженному снижению интенсивности кровотока в больших полушариях и нарушению оксигенации мозга [16]. Кроме того, известно, что в патогенезе острых нарушений мозгового кровообращения ишемиче-ского характера особо важную роль играет гипоксия. Следствием гипоксии в клетках является каскад метаболических изменений, центральными звеньями которого выступают энергетический обмен и СРО [11, 17].
Показано, что введение ТК в дозе 35 мг/кг животным при развитии ишемии-реперфузии головного мозга приводило к снижению содержания лактата в 2.8 раза по сравнению с животными с патологией. Содержание пирувата в данных условиях эксперимента возрастало в 1.9 раза. На фоне введения ТК в дозе 70 мг/кг параметры энергетического метаболизма восстанавливались до исходного уровня (таблица), что свидетельствует о наличии у ТК церебро-протективного действия при постишемической ре-перфузии головного мозга.
Кроме того, введение ТК в дозе 35 и 70 мг/кг приводило к снижению соотношения лактат/пируват в 5.2 и 8.5 раза по сравнению с животными с патологией (таблица). Очевидно, это связано с тем, что ТК способствует трансформации лактата в пируват и действует как кофермент окислительного декарбоксилирования пирувата и 2-ок-соглутарата, препятствуя развитию метаболического ацидоза.
«
&200 н
150
50
(а)
Контроль
II
III
IV
V VI
Группа животных
250
150
50
(б)
Контроль
III
IV
V VI
Группа животных
Рис. 1. Содержание восстановленного глутатиона в ткани мозга (а) и сыворотке крови (б) крыс с ишемией-репер-фузией (II), при введении тиоктовой кислоты ложнооперированным животным в дозе 35 (III) и 70 мг/кг (IV), при введении тиоктовой кислоты животным с постишемической реперфузией в дозе 35 (V) и 70 мг/кг (VI). За 100% принимали значение содержания восстановленного глутатиона в группе контрольных (ложнооперированных) животных: в ткани мозга - 0.51 х 10-3 мМ/г ткани мозга, в сыворотке крови - 0.272 мМ/л.
Ишемические повреждения ткани головного мозга характеризуются интенсификацией процесса СРО, в контроле которого важное место занимает глутатионовая АОС.
Результаты проведенных исследований показали, что при развитии ишемии-реперфузии головного мозга у крыс наблюдается увеличение содержания в8Н в ткани мозга в 2.0 раза (рис. 1а).
Вместе с тем выявлено также увеличени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.